טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן
Summary
ייצור אנדוגני של תחמוצת החנקן (NO) מסדיר מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים. מתברר יותר ויותר כי שיבוש או dysregulation של איתות NO מבוסס מעורב מחלות אנושיות רבות. שיטות לכמת רלוונטי מטבוליטים אינו רשאי לספק סמנים ביולוגיים מנבא אבחון או הרומן של מחלות אנושיות.
Abstract
תחמוצת החנקן (NO) הוא חינם diatomic הרדיקלי כי הוא קצר ביותר חיו במערכות ביולוגיות (פחות מ 1 השני במחזור הדם) 1. אין לעשות שנחשב לאחד את מולקולות האיתות החשוב ביותר המיוצר בגופנו, ויסות הפונקציות החיוניות, כולל אך לא רק ויסות לחץ הדם, תגובה חיסונית ותקשורת עצבית. לכן זיהוי מדויק שלה וכימות של מטריצות ביולוגיות הוא קריטי כדי להבין את התפקיד של NO מחלה ובריאות. חיים כגון 1/2 קצר הפיזיולוגי של NO, אסטרטגיות חלופיות עבור זיהוי של תוצרי התגובה של הביוכימיה NO פותחו. כימות של מטבוליטים אין הרלוונטיים תאים ביולוגיים רבים מספק מידע רב ערך לגבי in vivo לא, הייצור הזמינות הביולוגית ואת חילוף החומרים. כל שעליך לעשות הוא דגימה תא יחיד, כגון דם או פלסמה לא תמיד לספק הערכה מדויקת של כל בוdy חסרי מעמד, בעיקר ברקמות. היכולת להשוות עם דם ברקמות נבחרים חיות הניסוי יסייע לגשר על הפער בין המדע הבסיסי לבין הרפואה הקלינית ככל כלי אבחון פרוגנוסטית של אין סמנים ביולוגיים בריאות ומחלות. לכן, אקסטרפולציה של מצב NO פלזמה או דם לרקמות ספציפיות של עניין היא כבר לא הגישה חוקי. כתוצאה מכך, שיטות להמשיך להתפתח ומאומתים המאפשרים זיהוי וכימות של מוצרים לא ולא הקשורה / מטבוליטים של תאים רבים של חיות הניסוי in vivo. הפרדיגמה הוקמה לביוכימיה NO מייצור ידי אין synthases על הפעלת מסיסים guanylyl cyclase (SGC) לחמצון בסופו של דבר אל ניטריט (NO 2 -) ו – ניטראט (NO 3 -) יכול לייצג רק חלק מתופעות של אין in vivo. האינטראקציה של מטבוליטים לא ולא הנגזרות עם thiols חלבון, אמינים משניים, ומתכות להקים S-nitrosothiOLS (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), ו-heme nitrosyl בהתאמה מייצגים-cGMP עצמאיים ההשפעות של NO וסביר לא פחות חשובים מבחינה פיזיולוגית כמו הפעלת SGC בשום. הבנה אמיתית של NO בפיזיולוגיה נגזר בניסויים ב vivo הדגימה תאים מרובים בו זמנית. המתודולוגיה החנקן (NO) תחמוצת היא מדע מורכב ומבלבל לעיתים קרובות מוקד ויכוחים רבים ודיון בנוגע NO ביוכימיה. הבהרה מנגנונים חדשים במעברי האותות שאין בה דבר תלוי ביכולת שלנו באופן ספציפי, סלקטיבי וברגישות לזהות ולכמת NO וכל רלוונטי אין מוצרים מטבוליטים של מטריצות ביולוגיות מורכבות. כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של הניטריט ו חנקתי על ידי HPLC, כמו גם זיהוי של NO חופשית דגימות ביולוגיות באמצעות ב chemiluminescence האוזון חוץ גופית מבוסס עם derivitazation הכימית כדי לקבוע את המקור המולקולרי של NO כמו גם vivo לשעבר עםאמבטיה איבר myography.
Protocol
Discussion
בשיטות שתוארו כאן כימות של מטבוליטים אין הרלוונטיים תאים ביולוגיים רבים תאפשר טביעת אצבע של הביולוגיה NO בבריאות ומחלות שיכולים להיות מתואם עם מדידות פונקציונליות של NO על ידי האנדותל. שיטות אלו דורשים הכנה מדגם פשוט עם פוטנציאל להתאים את קצב העברת נתונים גבוה. הכמות …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות הונג ג'יאנג, Ph.D. ו דיפה Parathasarthy, MPH, BDS לסיוע טכני.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| N-ethylmaleimide | Thermo Scientific | 23030 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 |
| Autosampler | Alcott | |
| DMT Myograph | AD Instruments | |
| PowerLab | AD Instruments | |
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
Riferimenti
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
- Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
- Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
- Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
- Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
- Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
