Analytische technieken voor het testen van stikstofoxide biologische activiteit
Summary
De endogene productie van stikstofoxide (NO) regelt diverse biologische functies. Het wordt steeds duidelijker dat verstoring of ontregeling van NO op basis van signalering is betrokken bij vele ziekten bij de mens. Methoden voor het kwantificeren van relevante NO metabolieten kunnen nieuwe diagnostische of prognostische biomarkers voor ziekte bij de mens.
Abstract
Stikstofoxide (NO) is een twee atomen vrije radicalen die extreem korte duur in biologische systemen (minder dan 1 seconde in het circulerende bloed) 1. NO kan worden beschouwd als een van de meest belangrijke signaalmoleculen die in ons lichaam, regelen van essentiële functies met inbegrip van maar niet beperkt tot regeling van de bloeddruk, immuunsysteem en neurale communicatie. Daarom zijn nauwkeurige detectie en kwantificering in biologische matrices is cruciaal voor het begrijpen van de rol van NO in gezondheid en ziekte. Met een dergelijke korte halfwaardetijd fysiologische NO, zijn alternatieve strategieën voor het detecteren van reactieproducten van NO biochemie ontwikkeld. De kwantificering van relevante NO metabolieten in verschillende biologische vakken levert waardevolle informatie met betrekking tot in vivo NO productie, biologische beschikbaarheid en de stofwisseling. Gewoon het bemonsteren van een enkele ruimte, zoals bloed of plasma niet altijd een nauwkeurige beoordeling van de gehele body geen status, met name in weefsels. De mogelijkheid om bloed te vergelijken met bepaalde weefsels bij proefdieren zal helpen de kloof tussen fundamentele wetenschap en klinische geneeskunde voor zover diagnostische en prognostische nut van NO biomarkers bij gezondheid en ziekte. Daarom is extrapolatie van plasma of bloed geen status aan specifieke weefsels van belang is niet langer een geldige benadering. Hierdoor methoden blijft en gevalideerd waarmee de detectie en kwantificering van NO en NO-producten / metabolieten in meerdere compartimenten proefdieren in vivo. De gevestigde paradigma van NO biochemie aan de productie door NO synthases tot activatie van oplosbare pGC (SGC) om eventuele oxidatie in nitriet (NO 2 -) en nitraat (NO 3 -) mag alleen vertegenwoordigen een deel van de effecten van NO in vivo. De interactie van NO en NO-afgeleide metabolieten eiwit thiolen, secundaire aminen en metalen S-nitrosothi vormenOLS (RSNOs), N-nitroso-verbindingen (RNNOs) en nitrosylverbindingen-heem respectievelijk vertegenwoordigen cGMP onafhankelijk effecten van NO en waarschijnlijk even belangrijk fysiologisch het activeren van sGC door NO. Een ware begrip van NO in de fysiologie is afgeleid van in vivo experimenten bemonstering meerdere compartimenten tegelijkertijd. Stikstofoxide (NO) methodiek is een complex en vaak verwarrend wetenschap en de focus van veel debatten en discussie over NO biochemie. De ontrafeling van nieuwe mechanismen en signaalwegen betrokken NO hangt af van ons vermogen om specifiek, selectief en gevoelig detecteren en kwantificeren van NO en NO alle relevante producten en metabolieten in complexe biologische matrices. Hier we een werkwijze voor snelle en gevoelige analyse van nitriet en nitraat door HPLC en detectie van vrije NO in biologische monsters met in vitro ozon gebaseerde chemiluminescentie met chemische derivitazation moleculaire bron van NO en ex vivo bepalenorgaanbad myography.
Protocol
Discussion
De hier beschreven methoden voor de kwantificering van relevante NO metabolieten in verschillende biologische compartimenten zal zorgen voor fingerprinting van NO biologie in gezondheid en ziekte die kan worden gecorreleerd met functionele metingen van NO door het endotheel. Deze methoden vereisen eenvoudige monstervoorbereiding met potentieel voor de aanpassing voor high throughput. De relatieve hoeveelheid van deze moleculen kan begrijpen productie van NO en metabolisme in een aantal experimentele modellen ziekte zelf…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag naar Hong Jiang, Ph.D. dank en Deepa Parathasarthy, MPH, BDS voor de technische bijstand.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| N-ethylmaleimide | Thermo Scientific | 23030 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 |
| Autosampler | Alcott | |
| DMT Myograph | AD Instruments | |
| PowerLab | AD Instruments | |
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
Riferimenti
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
- Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
- Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
- Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
- Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
- Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
