La devastazione delle colture di cereali da semi-infezione funghi ha spinto numerosi sforzi di ricerca per comprendere meglio le interazioni pianta-patogeno. Per studiare le interazioni semi-fungine in un ambiente di laboratorio, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per la quantificazione della riproduzione fungina, la biomassa, e la contaminazione da micotossine mediante biotest del kernel.
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Articolo metodologico
Quantificazione di colonizzazione fungina, sporogenesi, e la produzione di micotossine Uso Bioassays Kernel
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La putrefazione di cereali da seme-infettanti funghi rappresenta una delle più grandi sfide economiche a livello mondiale di produzione di cereali, per non parlare di gravi rischi per la salute umana e animale. Tra la produzione di cereali, il mais è probabilmente la coltura più colpita, a causa di agenti patogeni indotte perdite di integrità del grano e di semi di contaminazione da micotossine. I due micotossine più diffuse e problematiche per i coltivatori di mais e degli alimenti e dei mangimi sono processori aflatossina e fumonisina, prodotta da Aspergillus flavus e Fusarium verticillioides, rispettivamente.
Recenti studi molecolari delle interazioni pianta-patogeno hanno dimostrato promessa la comprensione dei meccanismi specifici associati con le risposte delle piante alle infezioni fungine e contaminazione da micotossine 1,2,3,4,5,6. Poiché molti laboratori utilizzando saggi kernel per studiare le interazioni pianta-patogeno, vi è la necessità di un metodo standard per quantificare diversi parametri biologici, cosìrisultati dei diversi laboratori possono essere cross-interpretato. Per un mezzo robusto e riproducibili per le analisi quantitative sui semi, abbiamo sviluppato in laboratorio e metodi di test del kernel successivi per quantificare la crescita di funghi, biomasse e contaminazione da micotossine. Quattro chicchi di mais sterilizzati vengono inoculati in fiale di vetro con una sospensione fungina (10 6) e incubati per un periodo predeterminato. Vial vengono scelti per il conteggio di conidi mediante analisi biomassa emocitometro, ergosterolo basato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), quantificazione aflatossine utilizzando un metodo AflaTest fluorometro, e quantificazione fumonisina mediante HPLC.
Protocollo
1. Kernel Bioassay mais
- Due settimane prima, la cultura dei patogeni fungini, in agar patata destrosio (PDA) a 28 ° C.
- Selezionare kernel con dimensioni e forma simili, preferibilmente appiattito in modo che giaceva a livello con la parte inferiore di fiale bioassay, e il luogo in provette da 50 ml Falcon. Kernel selezionati devono essere stati prodotti in concomitanza stesso ambiente per garantire età simile seme e la composizione metabolita.
- Superficie sterilizzare kernel agitando provette a temperatura ambiente per 5 minuti con il 70% di etanolo, 1 minuto con acqua sterile, e 10 minuti con ipoclorito di sodio al 6%. Risciacquare, tre....
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Discussione
I metodi descritti qui sono stati ampiamente testati e di comprovata robustezza nella generazione di risultati quantificabili per la colonizzazione fungina, sporogenesi, e la produzione di micotossine. Inoltre, questi metodi dovrebbe essere applicabile a semi di altre specie di piante che sono sensibili alla contaminazione da funghi micotossigeni (es. arachidi, grano, cotone, pistacchi, ecc.) Per competenti pianta-patogeno analisi di interazione, è imperativo che i semi essere mantenuto in vita. Un sito piccola ferit.......
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Dichiarazioni
Non ho nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Brandon Hassett e Carlos Ortiz per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal contributi NSF IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS-0925561 e al Dr. Michael Kolomiets, e dalla USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), la selezione vegetale AFRI e borsa di studio # 2010-85117 -20.539 a Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit e Kolomiets Michael.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Catalogo # | |
| Agar Potato Destrosio | Fisher Scientifico | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientifico | BP337-100 | |
| Incubazione contenitore di plastica | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Miscelatore | VICAM | 20200 | |
| 24 centimetri filtro pieghettato Papers | VICAM | 31240 | |
| 1,5 um microfibra di vetro | VICAM | 31955 | |
| Afla test della colonna | VICAM | G1024 | |
| Afrla test Developer | VICAM | 32010 | |
| Metanolo | VICAM | 35016 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientifico | AC14952-0025 | |
| Etanolo | Fisher Scientifc | AC39769-0025 | |
| C-18 estrazione colonna a fase solida (Prep settembre colonna SPE C18) | Fisher Scientifico | 60108-304 | |
| O-ftalaldeide (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g | |
| Acido borico | Fisher Scientifico | BP168-500 | |
| Sodio borato | Fisher Scientifico | RDCS0330500 | |
| Mercaptoetanolo | Fisher Scientifico | 45-000-231 | |
| HPLC Shimadzu LC-20at (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20at | |
| Zorbax ODS colonna (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl rivelatore a fluorescenza | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL | |
| Fosfato di sodio | Fisher Scientifico | AC38987-0010 | |
| FB1 standard | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg | |
| Cloroformio | VWR | MK444410 | |
| 13 mm con filtro per siringa membrana di nylon 0,45 um (HPLC) | Pall Life Science | 4426 | |
| Ergosterolo | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Scintillazione fiale | VWR | 66021-602 | |
| Cloruro di sodio | VICAM | G1124 |
Riferimenti
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M.
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Ristampe e permessi
