Summary

Isolatie en Cultuur van de Mens Fungiform Smaak papillen Cellen

Published: May 17, 2012
doi:

Summary

Ons doel was om een ​​reproduceerbare protocol voor het isoleren en onderhouden van lange termijn culturen van menselijke fungiform smaak papillen cellen te ontwikkelen. Cellen uit menselijk fungiform papillen, verkregen uit biopsie werden met succes gehandhaafd in cultuur voor meer dan acht passages (12 maanden) zonder verlies van levensvatbaarheid.

Abstract

Smaak cellen zijn zeer gespecialiseerde, met unieke histologische, moleculaire en fysiologische kenmerken die de detectie van een breed scala van eenvoudige stimuli en complexe chemische moleculen in voedsel mogelijk te maken. In de menselijke, individuele fungiform papillen bevatten van nul tot maar liefst 20 smaakpapillen. Er is geen vastgesteld protocol voor het kweken van menselijke smaak cellen, hoewel de mogelijkheid om smaak papillen cellen in cultuur te behouden voor meerdere celcycli zou van groot nut zijn voor het karakteriseren van de moleculaire, regeneratieve, en functionele eigenschappen van deze unieke zintuigcellen. Eerdere studies van smaak cellen zijn gedaan met behulp van vers geïsoleerde cellen in primaire culturen, explant culturen van knaagdieren, of semi-intacte smaakpapillen in het weefsel plakjes 1,2,3,4. Hoewel elk van deze voorbereidingen heeft voordelen, zou de ontwikkeling van lange termijn culturen hebben belangrijke voordelen, met name voor studies van smaak celproliferatie en differentiation. Verschillende groepen, waaronder de onze, zijn geïnteresseerd in de ontwikkeling en invoering van smaak celkweek modellen. De meeste pogingen tot cultuur smaak cellen hebben gemeld beperkte levensvatbaarheid, met cellen die normaal gesproken niet een duur langer dan 3-5 d 5,6,7,8. We hebben onlangs gemeld op een succesvolle methode voor de uitgebreide cultuur van knaagdieren smaak cellen 9. Wij hier melden voor de eerste keer dat de vestiging van een in vitro cultuur voor geïsoleerde menselijke fungiform smaak papillen cellen. Cellen uit menselijk fungiform papillen, verkregen uit biopsie werden met succes gehandhaafd in cultuur voor meer dan acht passages (12 maanden) zonder verlies van levensvatbaarheid. Cellen weergegeven vele moleculaire en fysiologische kenmerken vertonen van rijpe smaak cellen. Gustducin en fosfolipase C β2 (PLC-β2) mRNA gedetecteerd in vele cellen door reverse transcriptase-polymerase kettingreactie en bevestigd door sequencing. Immunocytochemie analyse toonde de aanwezigheid van Gustducin en PLC-β2 expressie in gekweekte cellen smaak. Gekweekte menselijke fungiform cellen ook verhoging van de intracellulaire calciumconcentratie te zien in reactie op geschikte concentraties van verschillende stimuli smaak geven dat smaakreceptoren en ten minste enkele van de signaalpaden aanwezig waren. Deze resultaten geven aan dat voldoende smaak cellen van volwassen mensen kunnen worden gegenereerd en onderhouden gedurende ten minste acht passages. Veel van de cellen behouden fysiologische en biochemische eigenschappen van acuut geïsoleerd cellen van de volwassen smaak epitheel om hun gebruik te ondersteunen als een model smaak-systeem. Dit systeem zal in staat stellen verdere studies van de processen die betrokken zijn bij proliferatie, differentiatie en functie van zoogdieren smaak receptor cellen in een in vitro voorbereiding.

Human fungiform smaak papillen worden gebruikt voor het vaststellen van de menselijke fungiform celkweek werden geschonken voor onderzoek in goed geïnformeerde toestemming onder onderzoeksprotocollen die werden beoordeelden goedgekeurd door de IRB commissie. Het protocol (# 0934) werd goedgekeurd door Schulman Associates Institutional Review Board Inc, Cincinnati, OH. Geschreven protocol hieronder is gebaseerd op gepubliceerde parameters gerapporteerd door Ozdener et al.. 2011 10.

Protocol

1. Het verkrijgen van de Mens Fungiform Smaak papillen Verwijder de vier tot acht menselijke fungiform smaak papillen van de dorsale zijde van het voorste gedeelte van de tong met behulp van gebogen voorjaar microscissors. Plaats direct in een isolatie oplossing (26 mM NaHCO 3, 2,5 mM NaH 2 PO 4, 20 mM glucose, 65 mM NaCl, 20 mM KCl, en 1 mM EDTA opgelost in nuclease-vrij water en filter-gesteriliseerd). 2. Human Fungiform Smaak papil…

Discussion

We hebben vastgehouden aan cellen verkregen uit menselijke fungiform smaak papillen voor meer dan 8 passages, verspreid over een periode van 12 maanden. Deze culturen genereren nieuwe cellen, waarvan vele in vitro rijpen tot de fase waarin drukken zij verschillende merkers volwassen smaakknop celtypen naast belangrijke moleculaire en fysiologische eigenschappen van smaak receptor cellen. De aanwezigheid van gustducin-en PLC-β2 immunoreactiviteit in subsets van gekweekte cellen is in overeenstemming met deze co…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Aimee Myers en Esi Quayson voor technische vaardigheden en hulp. Dit werk werd mede ondersteund door NSF 0216310 en Givaudan Inc subsidie ​​(NER).

Materials

Name of the reagent Company
MCDB 123 Sigma-Aldrich
Iscove’s DMEM Medium MediaTech
Elastase Sigma-Aldrich
Pronase E Sigma-Aldrich
Elastase Worthington
Soy bean trypsin inhibitor Worthington
Collagenase type 1 Worthington
Rat tail collagen type 1 BD Sciences
Fura-2 AM Molecular Probes
Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR Invitrogen
Leica TCS SP2 Spectral Confocal Microscope Leica Microsystems Inc.
Discovery-1 imaging station and Metamorph software Molecular Devices
Small fine-tip forceps and extra fine spring scissors Fine Science Tools

Riferimenti

  1. Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).
  2. Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells. Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).
  3. Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. J. Neurosci. 20, 7978-7985 (2000).
  4. Qin, Y. M., Shi, J. Q., Zhang, G. H., Deng, S. P., Wang, T. H. A reliable method to obtain cells of taste buds from fungiform papillae of mice. Acta Histochem. 112, 107-112 (2010).
  5. Spielman, A. I., Mody, I., Brand, J. G., Whitney, G., MacDonald, J. F., Salter, M. W. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells. Brain Res. 503, 326-329 (1989).
  6. Kishi, M., Emori, Y., Tsukamoto, Y., Abe, K. Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes. Neuroscienze. 106, 217-225 (2001).
  7. Ruiz, C. J., Stone, L. M., McPheeters, M., Ogura, T., Bottger, B., Lasher, R. S., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Maintenance of rat taste buds in primary culture. Chem. Senses. 26, 861-873 (2001).
  8. Stone, L. M., Tan, S. S., Tam, P. P., Finger, T. E. Analysis of cell lineage relationships in taste buds. J. Neurosci. 22, 4522-4529 (2002).
  9. Ozdener, H., Yee, K. K., Cao, J., Brand, J. G., Teeter, J. H., Rawson, N. E. Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem. Senses. 31, 279-290 (2006).
  10. Ozdener, M. H., Brand, J. G., Spielman, A. I., Lischka, F. W., Teeter, J. H., Breslin, P. A., Rawson, N. E. Characterization of Human Fungiform Papillae Cells in Culture. Chem. Senses. 36, 601-612 (2011).
  11. Gomez, G., Rawson, N. E., Hahn, C. G., Michaels, R., Restrepo, D. Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons. J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).
  12. Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium. J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).
  13. Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro. Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).
  14. Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population. Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).
  15. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297, H1-H7 (2009).

Play Video

Citazione di questo articolo
Ozdener, H., Spielman, A. I., Rawson, N. E. Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells. J. Vis. Exp. (63), e3730, doi:10.3791/3730 (2012).

View Video