Dissektion av vuxen mus utriculus och adenovirus-medierad bärande cellsinfektion
Summary
Mechanosensory hårceller är receptor-celler i innerörat. Den bäst karakteriserade<em> In vitro</em> Modellsystem av mogna däggdjursceller hårceller använder organkulturer av utricles från vuxna möss. Vi presenterar dissektion av den vuxna musen utriculus, och visar vi adenovirusmedierad infektion av stödjande celler i odlade utricles.
Abstract
Hörselnedsättning och störningar balans beror ofta på döden av mechanosensory hårceller, som är de receptor cellerna i innerörat. Eftersom det inte finns någon cellinje som är tillfredsställande representerar däggdjursceller hårceller, bygger forskning på hårceller på primära organ kulturer. Den bäst karakteriserade in vitro-modellsystem av mogna däggdjursceller hårceller utnyttjar organkulturer av utricles från vuxna möss (figur 1) 1-6. Den utriculus är en vestibulär organ och hårcellerna i utriculus är likartade i både struktur och funktion till hårcellerna i hörselorganet, det organ Corti. Den vuxna musen utriculus beredningen motsvarar en mogen sensorisk epitel för studier av de molekylära signaler som reglerar överlevnad, homeostas och död av dessa celler.
Däggdjursceller kokleära hårceller terminalt differentierade och inte regenereras när de förlorade. I icke-mamMali ryggradsdjur, hörsel eller vestibulära håret celldöd följs av en stark återhämtning som återställer hörsel-och balansrubbningar funktion 7, 8. Hårcell regenerering medieras av glia-liknande stödjande celler, vilka kommer i kontakt de basolaterala ytan av hårceller i det sensoriska epitelet 9, 10. Stödjande celler är också viktiga mediatorer av hår cellöverlevnad och död 11. Vi har nyligen utvecklat en teknik för infektion av stödjande celler i odlade utricles hjälp adenovirus. Användning adenovirus typ 5 (dE1/E3) att tillföra en transgen innehållande GFP under kontroll av CMV-promotorn, finner vi att adenovirus specifikt och effektivt infekterar stödjande celler. Stöd effektiviteten cellsinfektion är ca 25-50%, och hårceller som inte är infekterade (Figur 2). Viktigt finner vi att adenoviral infektion av stödjande celler inte leder till toxicitet för hårceller eller stödjande celler, celltal i Ad-GFP infsad utricles är ekvivalenta med de i icke-infekterade utricles (figur 3). Därför adenovirus-medierad genuttryck för att stödja celler odlade utricles ger ett kraftfullt verktyg för att studera rollerna som stödjande celler som mediatorer av hår cellöverlevnad, död och förnyelse.
Protocol
Discussion
Sensoriska hörselceller är känsliga för död orsakad av en mängd olika spänningar, innefattande åldrande, buller trauma och exponering för ototoxiska läkemedel, inklusive de aminoglykosidantibiotika och det antineoplastiska medlet cisplatin. Hos däggdjur död hår cell resulterar i permanent hörselnedsättning och / eller balans störningar. In vitro-modellsystem är kritiska verktyg för studier som syftar till att fastställa de cellulära och molekylära mekanismerna bakom håret celldöd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av avdelningen för Interna Forskning vid National Institute on Dövhet och andra störningar kommunikation. Ytterligare stöd kom från NIDCD 5R01 DC007613.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
| DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
| Penicillin G | Sigma | P3032 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
| Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
| sodium borohydride | Sigma | 452882 |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
| Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.
Riferimenti
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate. J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).
- Ou, H. C. Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).
- Chiu, L. L. Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).
- Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death. Hear Res. , 221-221 (2006).
- Matsui, J. I., Cotanche, D. A. Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).
- Ryals, B. M., Rubel, E. W. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail. Science. 240, 1774-176 (1988).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240, 1772-174 (1988).
- Shang, J. Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).
- Lahne, M., Gale, J. E. Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium. J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).
- Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin. Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).
- Matsui, J. I. Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo. J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).
- Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).
- Nakagawa, T. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res. 176, 1-2 (2003).
- Forge, A., Li, L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res. 139, 1-2 (2000).
- Liu, W. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death. Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).
- Francis, S. P. Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32). Cell Death and Disease. , (2011).
- Wang, J. Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss. Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).
- Bird, J. E. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear. J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).
- Sato, E. Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).
