Yetişkin Fare kesecik ve Adenovirüs aracılı Yardımcı hücre Enfeksiyon Diseksiyonu
Summary
Mechanosensory saç hücreleri iç kulak reseptör hücrelerdir. En-karakterize<em> In vitro</emOlgun memeli saç hücrelerinin> model sistem yetişkin farelerin utricles organ kültürleri kullanır. Biz yetişkin fare kırbacık diseksiyonu mevcut ve biz kültürlü utricles hücreleri destekleyici adenovirüs aracılı enfeksiyonu gösterir.
Abstract
İşitme kaybı ve denge bozuklukları genellikle iç kulağın reseptör hücreler mechanosensory saç hücrelerinin ölümüne neden olur. Tatmin edici bir memeli saç hücrelerinin temsil hiçbir hücre hattı olmadığı için, saç hücreleri üzerinde araştırma birincil organ kültürleri dayanır. Yetişkin fareleri (Şekil 1) 1-6 arası utricles organ kültürü kullanan saç olgun memeli hücrelerine in vitro model sisteminde en karakterize edilmektedir. Kırbacık bir vestibuler organ ve kırbacık bir saç hücreleri işitsel organ, Corti organda saç hücreleri için yapıyı ve işlevi iki benzerdir. Yetişkin fare kırbacık hazırlık yaşam, homeostasis, ve bu hücrelerin ölümüne düzenleyen moleküler sinyallerin çalışmaları için olgun bir duyu epiteli temsil eder.
Memeli koklear saçlı hücreler ölümcül farklılaştığı ve kayboldukları zaman yeniden değildir. Non-mam olarakmemeli omurgalılar, işitsel ve vestibüler saç hücre ölümü işitme ve denge fonksiyonları 7, 8 geri sağlam rejenerasyon tarafından takip edilir. Saç hücre rejenerasyon duyu epitel 9, 10, saç hücrelerinin bazolateral yüzeylerine temas glia benzeri destekleyici hücreleri, aracılık eder. Yardımcı hücreler de saç hücre yaşam ve ölüm 11 önemli moleküllerdir. Yakın zamanda adenovirüs kullanılarak kültüre utricles hücreleri destekleme enfeksiyonu için bir teknik geliştirilmiştir. CMV arttırıcının kontrolü altında GFP içeren bir transgen sağlamak için adenovirüs tip 5 (dE1/E3) kullanılarak, özel olarak bu adenovirüs bulur ve verimli bir şekilde desteklemek hücreleri enfekte. Hücre enfeksiyonu verim destekleyici yaklaşık% 25-50 olduğu, ve saç hücreleri (Şekil 2) enfekte değildir. Daha da önemlisi, biz hücreleri destekleyici adenoviral enfeksiyonu saç hücreleri veya destekleyici hücrelere toksisite yol açmaz bulmak gibi Ad-GFP inf hücre sayılarıSeniyye utricles non-enfekte utricles (Şekil 3) bu eşdeğerdir. Böylece kültür utricles hücreleri desteklemek adenovirüs aracılı gen saç hücre yaşam, ölüm ve yenilenme arabulucular olarak hücreleri destekleyici rollerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.
Protocol
Discussion
Duyusal saç hücreleri yaşlanma, gürültü travma ve aminoglikozid antibiyotikler ve antineoplastik sisplatin içeren ototoksik ilaçlar, maruz kalma dahil stresler, çeşitli kaynaklanan ölüm duyarlıdır. Kalıcı işitme kaybı ve / veya denge bozukluğu memeliler saç hücre ölümü sonuçlarında. In vitro model sistemlerde hücresel ve moleküler mekanizmalar yatan saçları hücre ölümü yanı sıra saç hücre ölümü önlemek veya tersine çevirmeyi amaçlayan bu belirlenmesine yönel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir. Ek destek NIDCD 5R01 DC007613 tarafından sağlandı.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
| DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
| Penicillin G | Sigma | P3032 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
| Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
| sodium borohydride | Sigma | 452882 |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
| Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.
References
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate. J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).
- Ou, H. C. Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).
- Chiu, L. L. Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).
- Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death. Hear Res. , 221-221 (2006).
- Matsui, J. I., Cotanche, D. A. Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).
- Ryals, B. M., Rubel, E. W. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail. Science. 240, 1774-176 (1988).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240, 1772-174 (1988).
- Shang, J. Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).
- Lahne, M., Gale, J. E. Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium. J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).
- Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin. Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).
- Matsui, J. I. Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo. J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).
- Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).
- Nakagawa, T. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res. 176, 1-2 (2003).
- Forge, A., Li, L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res. 139, 1-2 (2000).
- Liu, W. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death. Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).
- Francis, S. P. Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32). Cell Death and Disease. , (2011).
- Wang, J. Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss. Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).
- Bird, J. E. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear. J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).
- Sato, E. Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).
