マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離
Summary
フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit +細胞と細胞および分子研究のための造血幹細胞を精製するために細胞選別の磁気濃縮に基づいています。
Abstract
骨髄は、造血幹細胞とより成熟した血液細胞系列の前駆細胞が存在すると成人生体内で分化する主要なサイトです。造血幹細胞は、生命時間1のすべての血液細胞系列を生成することができる多能性細胞の分細胞集団を構成しています。骨髄中の造血幹細胞恒常性の分子解剖は、造血、腫瘍学、再生医療において重要な意味を持っています。我々は個々のマウス（ 図1）造血前駆細胞サブセットと造血幹細胞の分布を獲得するためにフローサイトメトリーで蛍光抗体、電子ゲートの手順でラベルプロトコルを記述します。加えて、我々は広範囲に造血前駆細胞と同様に長期的（LT）およびc-Kitを発現する細胞の磁気濃縮によりプールされた骨髄細胞懸濁液から造血幹細胞を再構成する短期（ST）を豊かにする方法について説明します。得られた細胞調製物は、in vitroで選択したサブセットをソートするために使用することができ、生体機能研究である（ 図2）。
両方の海綿骨芽細胞2,3と類 洞内皮4は、骨髄中の造血幹細胞をサポートする機能的なニッチを構成しています。そのリガンドであるアンジオポエチン-1 5とN-カドヘリン+骨芽細胞3とHSCで発現する受容体チロシンキナーゼTie2の相互作用のサブセットを含む、骨芽細胞ニッチのいくつかのメカニズムは、造血幹細胞の休止を決定する際に同意する。骨髄中の"休止状態"は、レプリケーションや過度のサイクリング活動の6時の最終的な疲労から造血幹細胞を保護するために重要である。そのようなToll様受容体リガンドとしての自然免疫系の細胞7、インターフェロン-α6に作用する外因性の刺激はまた系統コミットされた前駆細胞に造血幹細胞の増殖と分化を誘導することができる。最近では、LIN内で休眠中のマウスの造血幹細胞の集団–のc-Kit + Sca-1は+ CD150 + CD48 – CD34 –人口が8に記載されています。ここで説明したように造血前駆細胞に富む細胞懸濁液からCD34の発現に基づいてセルの並べ替えは、静止自己再生LT-HSCとST-HSCの9の両方の分離を可能にします。系統陽性細胞の枯渇とCD48とFlk2抗体とLT-HSCのソートに基づいて同様の手順では、以前に10に記載されている。本報告では、表現型の特性と異なる生理学的および病理学的条件下で造血を監視するために有用である造血前駆細胞のex vivoでの細胞周期解析のためのプロトコルを提供しています。さらに、細胞生物学、シグナル伝達アッセイと同様に移植のために彼らの自己再生、拡大と分化を制御する要因とメカニズムを定義するために使用することができ造血幹細胞、の手順をソートFACSを説明します。
Protocol
Discussion
ここで説明する方法は、個々のマウス（ 図1）における造血の迅速かつ正確な分析を可能にします。マウス炎症モデルでは、自己免疫疾患、免疫不全、変性疾患、代謝性疾患および癌を含む様々な実験設定ではこの分析は、造血における病理学的条件の影響に対処することができます。 図3は、電子的にゲートLKSにおける細胞周期活性の分析を示しています。 </su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、貴重なアドバイスを信行紀夫、仁滝沢とマルクスマンツに感謝します。この作品は、スイス国立科学財団、スイスのがんリーグとFondazione Ticinese当たりラ未公表スルCancroによって資金を供給された。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
Riferimenti
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, . Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
