Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen
Summary
Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.
Abstract
De ontwikkeling en het onderhoud van immunosuppressieve CD4 + regulatoire T-cellen (Tregs) dragen bij tot de perifere tolerantie die nodig is om in de immunologische homeostase te blijven met de enorme hoeveelheid van het zelf en commensale antigenen in en op het menselijk lichaam. Verstoringen in de balans tussen Tregs en inflammatoire conventionele T-cellen kan leiden tot immunopathologie of kanker. Hoewel de therapeutische injectie van Tregs is aangetoond effectief te zijn in muismodellen van colitis 1, type I diabetes 2, reumatoïde artritis en graft versus host disease, 4 verschillende fundamentele verschillen in de mens versus de muis Treg biologie 5 is tot nu toe uitgesloten klinisch gebruik. Het gebrek aan voldoende, zuiverheid, stabiliteit en homing specificiteit van therapeutische Tregs noodzakelijk een dynamisch platform van de menselijke Treg ontwikkeling waarop de voorwaarden te optimaliseren voor hun ex vivo expansie 6.
Hier hebben we D Derenderen een methode voor de differentiatie van de geïnduceerde Tregs (iTregs) van een humaan perifeer bloed donor die kunnen worden onderverdeeld in vier stadia: isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen, magnetische selectie van CD4 + T-cellen, in vitro celkweek en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) van T-cel subsets. Aangezien de Treg handtekening transcriptiefactor forkhead box P3 (Foxp3) is een activatie geïnduceerde transcriptiefactor bij mensen 7 en andere unieke marker is, een combinatoriële panel van markers worden gebruikt om T-cellen herkennen suppressor activiteit. Na zes dagen kweken kunnen cellen in het systeem wordt begrensd in naïve T-cellen, T-cellen of geheugen iTregs basis van hun relatieve expressie van CD25 en CD45RA. Als het geheugen en de naïeve T-cellen hebben verschillende gemeld polarisatie eisen en plasticities 8, voorsortering van de eerste T-cel populatie in CD45RA + en CD45RO + subsets kunnen be gebruikt om deze verschillen te onderzoeken. In overeenstemming met anderen, onze CD25 Hi CD45RA – iTregs hebben hoge niveaus van Foxp3 9, GITR en CTLA-4 11 en lage niveaus van CD127 12. Na FACS van elke populatie kunnen resulterende cellen worden gebruikt in een suppressor assay de relatieve vermogen om proliferatie van carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) gelabelde autologe T cellen te vertragen evalueert.
Protocol
Discussion
Terwijl Treg overdracht bezit enorme therapeutische belofte bij de bestrijding van auto-immuniteit afstoting van het transplantaat en andere immuun-of inflammatoire-gemedieerde aandoeningen, methoden voor hun efficiënte generatie en stabiele onderhoud zijn nog niet ontwikkeld. Aangezien slechts 1-5% van de circulerende humane T-cellen zijn Tregs, hun gecontroleerde expansie en differentiatie lost dit gebrek als een belangrijke afschrikkende werking van de uitvoering van Tregs in de kliniek. Aan de andere kant, zoals we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
References
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
- Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
- Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
- Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
- Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
- Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
- Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
- McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
- Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
- Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
- Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
- Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).
