דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון
Summary
אנו מתארים שיטה להפקת תאים T זיכרון הרגולציה, ואת נאיבי מתורם דם אחת האדם. Tregs מקוטב ניתן להשוות ואז תת אחרים במגוון רחב של יישומים גנטיים פונקציונלי עם הומוגניות גנטית, כולל assay דיכוי מפורטים גם כאן.
Abstract
פיתוח ותחזוקה של מערכת החיסון CD4 + ותאי T רגולטוריים (Tregs) לתרום סובלנות היקפי צריכה להישאר הומאוסטזיס חיסוניות עם סכום עצום של אנטיגנים עצמיים ו commensal ב ועל גוף האדם. הפרעות במאזן בין Tregs ו דלקת בתאי T קונבנציונאלי עלול לגרום immunopathology או סרטן. למרות הזרקת הטיפולי של Tregs הוכח להיות יעיל במודלים Murine של 1 קוליטיס, אני סוכרת סוג 2, דלקת פרקים שגרונית שתל מול המחלה המארח, 4 הבדלים בסיסיים כמה אדם לעומת העכבר Treg ביולוגיה 5 יש ובכך מנעה הרבה בשימוש קליני. היעדר מספר מספיק טוהר, יציבות וספציפיות הביות של טיפולי Tregs חייבה פלטפורמה דינמית של התפתחות Treg האנושי שבו כדי לייעל את התנאים להרחבת vivo לשעבר שלהם 6.
כאן אנו דescribe שיטה בידול של המושרה Tregs (iTregs) מתורם דם אדם יחיד היקפי אשר ניתן לפרק לארבעה שלבים: בידוד של כדוריות דם היקפיים mononuclear, בחירת המגנטי של CD4 + T תאים, על תרבית תאים במבחנה הקרינה הופעלה התא מיון (FACS) של תת התא טי. מאז החתימה Treg גורם שעתוק forkhead תיבת P3 (FoxP3) הוא גורם ההפעלה הנגרמת שעתוק בבני אדם 7 ולא סמן ייחודי אחר קיים, פאנל קומבינטורית של סמנים יש להשתמש כדי לזהות תאים T עם פעילות מדכא. לאחר שישה ימים בתרבית, תאים במערכת שלנו ניתן התחום לתאי ה-T נאיבי, חולצות זיכרון תאים או iTregs המבוססים על הביטוי היחסי של CD25 ו CD45RA. כמו זיכרון תמים ותאי T שונים יש דרישות דיווח קיטוב ו plasticities 8, לפני מיון של האוכלוסייה התא הראשוני T לתוך CD45RA + ו + תת CD45RO יכול בדואר רגיל לבחון התאמות אלה. עולה בקנה אחד עם אחרים, CD25 שלנו היי CD45RA – iTregs רמות גבוהות של אקספרס FoxP3 9, GITR ו CTLA-4 ו 11 רמות נמוכות של CD127 12. בעקבות FACS של האוכלוסייה בכל התאים כתוצאה ניתן להשתמש assay מדכא אשר מעריכה את היכולת ביחס לעכב את הפצת carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE), שכותרתו עצמיים בתאי T.
Protocol
Discussion
תוך העברת Treg טומן בחובו הבטחה טיפולית עצומה במאבק נגד השתל אוטואימוניות דחייה הפרעות חיסוניות או דלקתיים בתיווך אחרים, שיטות לייצור יעיל שלהם ותחזוקה יציבה טרם פותחו. כמו שרק 1-5% במחזור של אדם ותאי T הם Tregs, הרחבה מבוקרת שלהם בידול מתגבר על זה מיעוט אמצעי הרתעה משמעותי …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
References
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
- Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
- Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
- Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
- Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
- Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
- Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
- McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
- Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
- Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
- Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
- Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).
