マウスモデルにおける静脈内自己投与方法

Summary

静脈内自己投与（IVSA）パラダイムは、げっ歯類における乱用薬物の強化特性を調べるのゴールドスタンダードであると考えられている。本稿では、このような信頼性の高いIVSAデータを得るために必要な実験手順と手術手技の概要を説明します。具体的には、細心のカテーテル注入及びメンテナンスが強調表示されます。

Abstract

動物モデルは静脈内自己投与（IVSA）パラダイムを含む薬物の補強効果を研究するために開発されている。コカインなど薬物乱用の補強特性を研究するためにIVSAパラダイムを使用することの利点は、薬剤ではなく、自己投与実験者が投与し、補強のスケジュールを変更することができるである旨及び量の正確な測定を含む薬だけでなく、消費タイミングおよびIV注射のパターンを得ることができる。また、投与経路は静脈内初回通過代謝や味に関連する潜在的な交絡を避けることができ、血液および脳薬物濃度の急激な増加を生成します。このビデオで概説したように、静脈内自己投与はフラッシングとメンテナンス手術と細心の毎日の中に慎重にカテーテルカテーテル留置後に事前の食事制限や事前の薬物研修なく得ることができる。これで概説実験手順本稿では、動物の収容及び馴化法の説明、加糖ミルクソリューションを使用してオペラント訓練、カテーテル移植手術が含まれています。

Protocol

1。動物の住宅·環境に順応する手順雄と雌CD-1マウスは、水のボトルや食品を収容するためにワイヤグリッドふたで、ベータチップ寝具、nestletパッドを含む標準的なプラスチックのケージには、最大ケージあたり5匹に、同性の同腹子と収容されています。標準マウス飼料と水は実験を通してホームケージ内を自由に摂取可能です。 マウスは逆明暗スケジュール（22:00〜10:00に点灯）で維持されます。 マウスは、実験手順の開始前1週間IVSA試験室に順応させている。 2。オペラントトレーニング加糖ミルクトレーニングや静脈内薬物自己投与セッションを含むすべての行動手順は2超高感度マウスレバー、ひしゃくカップ、刺激が点灯し、マイクロシリンジポンプ（メッドAssoci装備15.9×14×12.7センチメートル、測定オペラントチャンバーを用いて行われるATES社、セントオールバンズ、バーモント州、米国）。チェンバースは強化スケジュールをプログラムし、データを収集するために、メッド·アソシエイツスマートCRインターフェイスとMED-PCソフトウェアを使用してコンピュータに接続されます。 ナイーブマウスはオペラントチャンバーに慣らさとひしゃくカップで提示加糖ミルク報酬（0.1ミリリットル）を使用してレバー押すように訓練される。オペラントミルクトレーニングは5-7日間1時間のセッションで行われている。アクティブレバーの固定比率（FR）スケジュールの完了は、ひしゃくのカップと刺激光の照明のプレゼンテーションとなりました。加糖牛乳ソリューションは、全乳（3.25％脂肪含量）に追加スクロース（10 mg / mlで、ACS試薬、シグマアルドリッチ社サン·ルイ、MO、USA）から成っていた。加糖ミルク溶液または液状食品補強とオペラント訓練はマウス1,2における自発的反応を促進するために使用される一般的な手法です。 3。手術中に使用する機器の準備のrequIRED設備 – 20、23および26ゲージ針、グラインダー、1ccの注射器、Tygonチューブ、ハンダごて、ヘパリン、抗生物質と鎮痛剤。 20ゲージの針を下に削って頸静脈にカテーテルの挿入を導くために針を準備します。針のシャフトを静脈内にカテーテルチューブを誘導するために針内のチャネルを形成するために、グラインダーを使用してシャットダウン削られる。ニードルチャンネルは慎重に寄託されている可能性のある金属製の破片のためにチェックする必要があります。チャネルへの障害物は、微細な先端の鉗子を用いて掻きすべきである。 カテーテルをフラッシュし、チェックするために使用される2つの1 ccのシリンジを適応させる。 Tygonチューブの12cmの部分を取って、1ccの注射器に貼付26ゲージの針に一端にそれらを添付し、23ゲージの針を介してチューブのもう一方の端を延伸することによって2つのシリンジを準備します。一方のシリンジは、0.9％滅菌生理食塩水とチカルシリンのヘパリンチカルシリン溶液（と他の33ミリグラムで満たされるべきと滅菌生理食塩水10ミリリットル当たりのヘパリンの0.3 mg）を得た。 カテーテルカニューレのキャップを準備します。タイゴンチューブは、23ゲージの針に掛け、ベベルから1cmにカットされます。厚いシールを作成するためのチューブの開放端を溶かす。チューブは全体カニューレキャップがカニューレの端の上にぴったりと密封端金具に、カテーテルカニューレ上にフィットするのに十分な長さになるように溶融されるべきである。キャップが長すぎる場合、それはスクリューオンカテーテルカバーを取り付けるの過程で曲がって、その後刺される危険性があることに注意してください。したがってカテーテルキャップの入念な準備をカニューレに良いフィット感を提供するために、推奨されます。 必要なソリューションを準備します。すべての試薬はSigma-Aldrich社（サン·ルイ、MO、USA）から購入しています。 カテーテルのフラッシュのためのヘパリン化チカルシリンソリューション – 0.33グラムチカルシリン（ナトリウム塩）と滅菌生理食塩水10ml中のヘパリンの0.003グラムを溶かす。ソリューションの0.03ミリリットルはTHRフラッシュされウワーッ毎日カテーテル。抗生物質溶液は、開発から血栓や感染症を予防するために投与される。 皮下注射用Amikicin（抗生物質） – 単回皮下注射は、術後感染症を防ぐために、10 mg / kgの用量で手術の後に指定されています。 皮下注射のためにケトプロフェン（鎮痛剤） – 単回皮下注射は、どの手術後の痛みを管理するために、5 mg / kgの用量で手術の後に指定されています。 4。カテーテル移植手術必要な機器と試薬：イソフルラン、滅菌生理食塩水、アルコール（70％）、滅菌生理食塩水で満たされた1と3 ccの注射器、1-CC適合した注射器は、上記のセクション3で調製した抗生物質と鎮痛剤ソリューション、マウスカテーテル（CamCaths、ケンブリッジ、イギリス）、カテーテルカバー（HRSの科学、モントリオール、ケベックから結晶キャップ）、眼潤滑剤、（この静脈を昇格させるには、4センチメートルプラスチックバープラスチック製のQ-ティップ）、polysporin、滅菌綿棒、ガーゼ、曲線と直線鉗子、動脈クランプ、細かいハサミから構築することができる。 標準的な無菌技術外科ベンチ、手術器具を使用し、カテーテルは手術前に滅菌される。適切な滅菌技術はCamCathsから購入した手術器具やカテーテル用オートクレーブ水蒸気が含まれています。ガラスビーズ滅菌はまた、手術器具の先端に使用することができます。エチレンオキシド滅菌は、リスク融解、より繊細なカテーテルまたは材料に用いることができる。げっ歯類の外科無菌技術のより詳細な説明は、アタッチされた参照の1,2に記載されています。ベンチの設定、保守、麻酔のための楽器とノーズコーンは、写真に示されている。 マウスは、イソフルランで麻酔ガスであり、掃気システムの下で呼吸管を使用して麻酔下で維持した。瞳の潤滑剤（涙ナチュラルPM）は手順の間に、乾燥を防ぐために、両方の目に適用されます。適切な外科的マージンは動物の背中や首の周りに剃られています。任意の切開が行われる前に、外科分野は、滅菌ドレープを使用して制限されています。 心臓の右心房に挿入するためのカテーテルを準備するために、過剰なカテーテルチューブ、カテーテルの電球から1.2 cmに切断される。これが大人のCD-1マウスに、生後約8週、20〜25グラムの体重のために確立された最適な長さです。カテーテルチューブの長さは、マウスの系統、大きさや年齢に基づいて、（試行錯誤して）若干調整する必要があります。挿入する前に、滅菌生理食塩水（3.2節）を含む注射器、カテーテル、カニューレに取り付けられており、カテーテルをフラッシュし、漏れがないかチェックされます。保つこの注射器は、外科的処置を通してカテーテルに接続されている。これは、カテーテルをフラッシュし、ステップ4.7で血を引くために使用されます。 70％アルコールでは、次の滅菌は、2cmの長midscapular切開が背中の途中に開始し、カテーテルの基を収容するために、ちょうど首の下に終了される。結合組織は、皮膚の下にカテーテルベースの​​ためのスペースを作るためにピンセットでバラバラに強制されるべきである。 その裏に動物を置き、第二浅1 – 面積を70％アルコールでスワブされた後に2センチメートル斜めの切開は、動物の顎に上向きに行く右鎖骨から作られています。頸静脈は首の皮膚の下に表面的に検索することが可能になります。カテーテルの挿入のための準備では、カテーテルの基部からチューブが背中に切開を通して引っ張られるとちょうど肩の上の皮膚の下にチューブを通すことによって近い頸静脈に近づける。カテーテルチューブの終わりですその後、動脈鉗子に取り付けられており、それの場所で保つために、動物の側に配置されます。 右頸静脈を穏やかに動物の首の周りの切開部から表面的な結合と脂肪組織を離れることに位置しています。静脈周囲の結合組織は、湾曲鉗子を用いてバラバラに壊れていると静脈は、その後、滅菌したプラスチックバーを使用して上昇している。緩いオープン縫合糸の結び目は、静脈の各端のまわり作られており、カテーテルチューブはトップノットに通し、右の肩の上にクランプ休むために縫合糸の上にループバックされます。 挿入する前に、湿式摩擦を減らすために滅菌生理食塩水で20ゲージの穿刺針と静脈の両方。針が静脈に平行に開催され、高架静脈（ 注：針先端の約0.5cmが静脈を入力する必要があります）の底部近くにそっと挿入されます。ピンセットを用いて、静脈に針のシャフトダウンカテーテルチューブをスライドさせます。抵抗はチュービング私ことを示すことになる静脈内の結合組織ではなく秒以内。漏れがないことを確認するために静脈を介して生理食塩水の0.03 ccを押してください。リークは、静脈がピアスやカテーテルチューブの配置調整が必要なことをすることができることを示すことになる。 注意：チューブは静脈内であるかどうかを確認するには、添付された生理食塩水を注射器を用いていくつかの血を描画しようとする。血液はすぐに描くことができない場合は、静脈や心臓の壁がカテーテル先端を閉塞してもよいし、静脈を刺されていません。チューブを調整して、もう一度試してください。血液はまだ策定できない場合は針の再挿入が必要になることがあります。 所定の位置にカテーテルを確保するために、挿入ポイントにカテーテルバルブを押して針を外します。底結び方をしてから、電球、上記第二の結び目を結ぶ前に、右のバーに対して、カテーテルのフラッシュを引く。必要に応じて血液が策定されることができるかどうかを確認し、わずかに結び目を緩めるためにもう一度テストします。皮膚や縫合糸の下でカテーテルチューブを押し込み動物の首の周りに腹切開。滅菌綿棒のアプリケーター、または好ましくは閉鎖切開にいくつかの鎮痛剤を含む他の抗生物質軟膏を使用してファストヒールPolysporin適用されます。 その腹部に動物と、準備された切開内に背中の皮膚の下にカテーテルベースを置く。過剰チューブは最小限にループとよく噛んで、それを刺す動物の可能性を最小限に抑えるために、カテーテルベースの​​下に隠されていることを確認してください。カテーテルベースの​​両側に切開を縫合し、滅菌綿棒のアプリケーターを用いてPolysporinヒールファストを適用します。 それに貼付チューブ（3.2節）とシリンジを用いてヘパリン加チカルシリン液0.03 ccでカテーテルをフラッシュします。白カテーテルカバーのプラスチックカニューレのキャップとネジでカニューレをキャップ。カニューレに蓋をされる前に、手術からの新鮮ないくつかのマウスでは、血がカテーテルから漏れる可能性があります。それは再フラッシュ動物とrapidlにとって重要である血液が流出する機会を得る前にyがカニューレのキャップを交換してください。動物は、カテーテルの開存性を維持するために日常的にフラッシュする必要があります。 70％エタノールで動物後ろ脚の間に注入領域を下に拭いた後、皮下に片側に5 mg / kgの用量で鎮痛ケトプロフェンを注入し、反対側に10 mg / kgの用量で抗生物質amikicin。 麻酔が中止された後、動物を5から7日間の食料や水へのアクセスも簡単できれいにケージに回復させる。マウスは、手術後の低体温症を防ぐために一晩加熱したキャビネットに配置する必要があります。 5。行動試験 – 静脈内自己投与行動試験カテーテルの前には、0.9％滅菌生理食塩水でフラッシュする。マウスはその後場所ですオペラントチャンバー内のdと輸液ラインと輸液ポンプに接続されています。アクティブレバーを押すと、刺激光の照明と相まって3.2秒18μlの薬剤注入につながる。各レバープレスは刺激光が消えている期間のうち8秒の時間が続きます。 オペラントセッションに続いて、マウスのカテーテルは、ホームケージに戻される前にヘパリン化チカルシリン液でフラッシュされます。 マウスを各投与量で、連続して3回2時間のセッションのために自己管理することが許可されています。以下のセクションで示されているように用量は、各マウスのランダムな順序で提示された。 カテーテルの開存性は、生理食塩水と抗生物質溶液の両方をカテーテルを通して洗い流されることを確実にすることで、毎日評価されています。添付された参考文献5で説明したようにまた、ミダゾラム/ケタミンテストを行うことができます。簡単に言えば、そのような0.02〜0.03ミリリットルケタミン（15 mg / ml）を注入5秒以内不動として麻酔の兆候、またはミダゾラム（0.75 mg / ml）のミダゾラムは、特許カテーテル5の証拠である。

Representative Results

図1：静脈内薬物自己投与の応答のパターンが採用薬剤、用量範囲とマウス系統によって異なります。提示の図は、ビデオで説明されている手順を使用して成功catherization手術後にコカイン自己投与のデータを示しています。図が示す平均（±SEM）でコカインの注入は稼いだと補強のFR1スケジュール上のランダムな順序で提示4コカイン用量の範囲で（±SEM）でコカイン消費量（mg / kg体重）を意味する。横軸：注入あたりの​​自己投与される薬剤の投与量。左縦軸：2時間オペラントセッション中に獲得した点滴の総数。右縦軸：2-HRのテストセッション中にmg / kgの総コカイン摂取。全13のカテーテルは、研究の期間（4週間）の特許に推移しました。用量で実施一方向ANOVAことが明らかになったマイクeは用量依存的にコカインを投与された[F（1,12）= 42.8、P <0.05]。用量反応曲線[F（3,36）= 29.6、P <0.05]、高用量で押圧レバーが減少したものの、オーバーコカイン消費量の増加があります。各データ点は、CD-1マウス（n = 13 /用量、雄と雌の合計）に収集する各コカインの用量で3テストセッションの平均（±SEM）を表しています。用量反応曲線を横切っ応答アクティブ（薬物強化）対非アクティブレバーの比較は、そのマウスは2つのレバーの間に肥えていたことを確認するために2-way ANOVAを用いて行った。 CD1マウスについては、分析がアクティブレバー[F（1,12）= 10.255、P <0.05]全体の用量 – 反応曲線上（データはここでは示していない）の優先順位を明らかにした。

Discussion

薬物乱用の動物モデルは、薬物関連行動の遺伝的基盤を理解する上で特に有用である。例えば、異なる遺伝的プロファイルを持つマウスは、コカイン^6-8彼らの感度の違いを遺伝と^9を観察^した表現型の変異性を媒介する可能性のある遺伝子候補を特定するのに役立ち示す。このホワイトペーパーで説明静脈カテーテル挿入の手順は、マウスだけでなく、さまざまな遺伝的背景¹⁰のマウスの様々な系統の薬物IVSAを調べるために、かなりの成功を収めて使用されてきた。

このビデオに示す手順では、中に集中する重要な要素を強調表示し、信頼性の静脈内自己投与のデータを得るためにcatherization手術後。まず、右心房内にカテーテルチューブの配置はブロットの塊からカテーテルの故障を防止するために、不可欠である。手術の間にそれは確認することが重要であるカテーテル端が妨げられ、心臓や静脈組織のどちらかによって閉塞されていません。第二に、毎日のカテーテルのフラッシュは目詰まりを防ぐために、オペラントセッションの前と後の両方で必要となります。動物が彼らのホームケージにいるときカニューレのキャップと結晶の両方がカバーと最後に、カテーテルカニューレは破片の侵入を防止するため、常にカバーされなければならない。カテーテルカニューレのマイナー閉塞が​​細かい26ゲージの針を用いて外れている可能性があり、しかし毎日の特に動物がIVSAためにテストされていない日には、必要とされるヘパリン化抗生物質溶液で洗浄。

動物の生存の手術、無菌技術についての十分な知識を実行するには、鎮痛と麻酔が必要です。このビデオは適切な手術トレーニングに代わるものではありませんが、それはこのパラダイムのために必要な技術を習得を希望する研究者のためのガイドとして使用することができる。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ticarcillin Disodium Salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	1 gram bottle
Tears Naturale P.M (Eye lubricant)	Alcon	N/A	3.5 gram tube This eye lubricant can be found in most pharmacies. Any ophthalmic eye lubricant can be used.
Cocaine	Medisca Pharmaceutique	0723-06	1 gram bottle
Ketamine	Medisca Pharmaceutique	1754-04	25 gram bottle
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	1 gram bottle
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	250 gram bottle
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	1 gram bottle
Amikicin Sulphate salt	Sigma-Aldrich	A2324-5G	5 gram bottle
Sucrose ACS Reagent	Sigma-Aldrich	S5016-500G	500 gram bottle
Standard mouse catheters with soft mesh	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Tubing specifications: 26SWG;0.451;0.254
Crystal cap applicator	HRS Scientific	313CAC	This is the white catheter cap.
Tygon Micro Bore Tubing	Thomas Scientific	9561S41	Tubing specifications (bore x o.d. x wall thickness in inches): .01 x .03 x .01