1. Animal Boliger og Akklimatisering Prosedyrer Mannlige og kvinnelige CD-en mus er plassert med samme kjønn kullsøsken, opp til 5 dyr per bur, i standard plastmerder inneholder beta chip sengetøy og nestlet pads, med wire grid lokk for å imøtekomme vannflasker og mat. Standard mus chow og vann er tilgjengelig ad libitum i hjemmet merdene hele eksperimentet. Mus er opprettholdt på en omvendt lys-mørke tidsplan (lysene på 22:00-10:00). Mus har lov til å akklimatisere til IVSA testing rom for en uke før starten av eksperimentelle prosedyrer. 2. Operant trening Alle atferdsmessige prosedyrer inkludert søtet melk trening og sprøytemisbrukere Selvadministrering økter utføres ved hjelp av operant kammer som måler 15,9 x 14 x 12,7 cm, utstyrt med to ultra-sensitive mus spaker, dipper kopper, stimulans lys og mikroliter sprøyte pumper (Med forbundAtes Inc., St. Albans, VT, USA). Kamre er interfaced til en datamaskin ved hjelp Med Associates Smart CR-grensesnitt og Med-PC-programvare for å programmere timeplan av armering og samle inn data. Naive mus habituated til operant kammer og trent for å jekke trykk ved hjelp av en søtet melk belønning (0,1 ml) presentert i en dipper cup. Operant melk gjennomføres på en-timers økter i 5-7 dager. Gjennomføring av en fast forhold (FR) tidsplan på den aktive spaken resulterte i presentasjonen av fossekallen koppen og belysningen av en stimulans lys. Den søtet melk løsning bestod av sukrose (10 mg / ml, ACS Reagent, Sigma-Aldrich Inc. St. Louis MO, USA) tilsatt til helmelk (3,25% fettinnhold). Operant trening med en søtet melk løsning eller en flytende mat forsterker er en vanlig teknikk som brukes for å lette operant svare på mus 1,2. 3. Utarbeidelse av utstyr som skal brukes under operasjonen RequIRED utstyr – 20, 23 og 26 gauge nåler, jeksel, en cc sprøyter, Tygon tubing, lodding jern, heparin, antibiotika og smertestillende. Forbered en nål til å veilede innsetting av kateteret inn i halsvenen ved barbering ned en 20 gauge nål. Skaftet på nålen er barbert ned ved hjelp av en slipemaskin for å danne en kanal innenfor nålen å lede kateteret slangen inn i venen. Nålen kanalen bør være nøye kontrollert for metall rusk som kan ha blitt deponert. Eventuelle hindringer til kanalen skal skrapes ut ved hjelp av fine tippet tang. Tilpasse to 1-cc sprøyter som skal brukes til å skylle og sjekke kateteret. Forbered to sprøyter ved å ta 12 cm biter av Tygon slange og feste dem i den ene enden til 26 gauge nåler festet til en cc sprøyter, og strekker den andre enden av slangen over 23 måle nåler. En sprøyte skal fylles med 0,9% sterilt saltvann, og den andre med en heparinisert Ticarcillin løsning (33 mg av Ticarcillinog 0,3 mg heparin pr 10 ml sterilt saltvann). Forbered kateter kanyle caps. Tygon tubing er strukket over en 23 gauge nål, og kuttet 1 cm fra fas. Smelt den åpne enden av slangen for å lage en tykk tetning. Slangen bør være smeltet slik at hele kanylen hetten er lang nok til å passe over kateteret kanylen, med forseglet endefestet snugly over enden av kanylen. Oppmerksom på at hvis lokket er for lang, er det en risiko for at det vil bli bøyd og deretter gjennomboret under prosessen av å feste påskrubar kateteret dekker. Således nøye forberedelse av kateter caps anbefales, for å tilveiebringe en god tilpasning til kanylen. Utarbeide nødvendig løsninger. Alle reagenser er kjøpt fra Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, USA). Heparinisert Ticarcillin løsning for kateter spyling – Oppløs 0,33 g Ticarcillin (dinatriumsalt) og 0,003 g av heparin i 10 ml sterilt saltvann. 0,03 ml oppløsning spyles through kateteret daglig. Antibiotika Oppløsningen gis for å forhindre blodpropp og infeksjoner fra utviklingsland. Amikicin (antibiotikum) for subkutan injeksjon – En enkelt subkutan injeksjon gis etter kirurgi ved en dose på 10 mg / kg for å forhindre post-operative infeksjoner. Ketoprofen (smertestillende) til subkutan injeksjon – En enkelt subkutan injeksjon er gitt etter operasjonen med en dose på 5 mg / kg til å administrere alle postoperative smerter. 4. Kateter Implantasjon kirurgi Nødvendig utstyr og reagenser: isofluran, sterilt saltvann, alkohol (70%), 1 og 3 cc sprøyter fylt med sterilt saltvann, 1-cc tilpasset sprøyter, antibiotika og smertestillende løsninger utarbeidet i § 3 ovenfor, mus katetre (CamCaths, Cambridgeshire, UK ), kateter deksler (krystall caps fra HRS Scientific, Montreal, Quebec), øye smøremiddel, 4 cm plast bar å heve vene (dettekan konstrueres fra en plast Q-tip), Polysporin, sterile kompresser og gasbind, buede og rette tang, arterie klemmer, fine saks. Ved bruk av standard aseptiske teknikker kirurgisk benken, den kirurgiske instrumenter, og kateter er sterilisert før operasjonen. Riktig sterilisering teknikker inkluderer damp autoklavering for kirurgiske instrumenter og katetre kjøpt fra CamCaths. Glass perle sterilisering kan også brukes på tuppen av kirurgiske instrumenter. Etylenoksid sterilisering kan være ansatt på mer delikat katetre eller materiale som risiko smelting. En mer detaljert beskrivelse av gnagere kirurgiske aseptiske teknikker kan bli funnet i den vedlagte referansene 1,2. Satt opp av benken, er instrumenter og nese kjegle for vedlikehold anestesi illustrert i bildet. Mus er bedøvet med isofluran gass, og vedlikeholdes under anestesi ved hjelp av en pusteslange under et skyllemedium system. Eye smøremiddel (Tears Naturale PM) brukes i begge øynene for å hindre dem fra å tørke ut under prosedyren. En passende kirurgisk margin er barbert på dyrets rygg og rundt halsen. Før noen snitt er gjort, er det kirurgiske felt begrenset ved hjelp av sterile forheng. For å forberede i kateteret for innsetting inn i høyre atrium av hjertet, er det overskytende kateter slangen avskåret 1,2 cm fra pære av kateteret. Dette er den optimale lengden etablert for voksne CD-en mus, ca 8 ukers alder, 20-25 gram kroppsvekt. Lengden av kateter tubing må kanskje justeres litt (ved prøving og feiling), basert på belastningen, størrelsen og alderen på musene. Før innsetting, er sprøyten inneholdende sterilt saltvann (avsnitt 3.2) festet til kateteret kanylen, og kateteret er spylt og kontrolleres for lekkasje. Holddenne sprøyten er festet til kateteret gjennom den kirurgiske prosedyren. Det vil bli brukt til å skylle kateteret, og trekke tilbake blod i trinn 4,7. Etter sterilisering med 70% alkohol, er en 2 cm lang midscapular innsnitt gjort starter midtveis på baksiden og slutter like under halsen for å imøtekomme basen av kateteret. Bindevev skal tvinges fra hverandre med pinsett for å gjøre plass for kateteret basen under huden. Plassere dyret på ryggen, en annen grunt 1 – 2 cm diagonalt innsnitt er gjort fra høyre krageben går oppover til dyr kjeve, etter at området har blitt penslet med 70% alkohol. Halsvenen vil bli funnet overfladisk under huden i nakken. Som forberedelse for innsetting av kateter, blir slangen fra bunnen av kateteret trukket gjennom snitt på baksiden og brakt nær halsvenen ved å føre slangen under huden like over høyre skulder. Slutten av kateteret slangen erderetter festet til en arterie klemmen og plassert på dyrets side for å holde den på plass. Den høyre vena jugularis ligger ved forsiktig beveger seg bort overfladisk bindevev og fettvev fra snitt rundt dyrets hals. Bindevev rundt venen er brutt i stykker med buede pinsett og venen er så opphøyet ved hjelp av en steril plast bar. Loose åpne suture knop er gjort rundt hver ende av venen og kateteret slangen er tredd gjennom den øverste knute og løkker over sutur tråden å hvile unclamped over høyre skulder. Før innsetting, våt både 20 gauge innsetting nål og vene med sterilt saltvann for å redusere friksjonen. Nålen holdes parallelt til venen, og satt forsiktig nær bunnen av forhøyede venen (Merk: ca 0,5 cm av nålespissen må legge inn vene). Ved hjelp av tang, skyv kateteret slangen ned i sjakten av nålen inn i venen. Motstand ville indikere at slangen is innenfor bindevev og ikke innenfor venen. Trykk 0,03 cc av saltvann gjennom venen for å sikre at det ikke er noen lekkasjer. Lekkasjer ville indikere at venen kan gjennomboret eller at kateteret slangen plassering må justeres. Merk: For å sjekke om slangen er innenfor venen, forsøke å trekke opp litt blod ved hjelp av vedlagte saltvann sprøyten. Hvis blodet ikke kan umiddelbart trukket opp, kan blodåre eller hjertet veggen skal tilstoppes kateterspissen, eller venen har ikke blitt stukket, justere slangen og prøv igjen. Needle gjeninnsetting kan være nødvendig hvis blod fortsatt ikke kan trekkes opp. For å sikre kateteret på plass, skyves kateter pære til innsettingspunktet og ta ut nålen. Knyt bunnen knute og trekk kateteret flush mot baren før knytte den andre knuten rett over pæren. Test på nytt for å se om blodet kan trekkes opp og løsne opp knutene litt hvis nødvendig. Brette kateteret slangen under huden og suturventrale snitt rundt dyrets hals. Påfør Polysporin Heal Rask med steril bomull applikator eller annen antibiotisk salve fortrinnsvis inneholdende noe smertestillende til lukket innsnitt. Med dyret på magen sin, plassere kateteret basen under huden på ryggen i den preparerte innsnitt. Pass på at overskytende slange er minimalt looped og godt gjemt under kateteret base for å minimere sjansene for dyret å tygge og piercing det. Suturere innsnitt på begge sider av kateteret base, og anvende Polysporin Heal Rask hjelp av en steril bomull applikator. Skyll kateteret med 0,03 cc av heparinisert Ticarcillin løsning ved hjelp av sprøyten med slangen festet til den (pkt. 3.2). Cap kanylen med plast kanyle cap og skru på den hvite kateteret dekselet. I noen mus som er friske fra kirurgi, kan blodet lekke ut av kateteret før kanylen er avkortet. Det er viktig å re-skylle dyret og rapidly erstatte kanylen cap før blodet har sjansen til å strømme ut. Dyr må spyles på en daglig basis for å opprettholde kateter patency. Etter tørke ned injeksjonsområde mellom dyrene bakre ben med 70% etanol, subkutant injisere den analgetiske ketoprofen i en dose på 5 mg / kg på den ene siden, og den antibiotika amikicin ved en dose på 10 mg / kg på den andre siden. Etter anestesi er avviklet, er dyr tillatt å komme i en ren bur med lett tilgang til mat og vann i 5 til 7 dager. Mus bør plasseres i en oppvarmet kabinett over natten for å hindre postoperativ hypotermi. 5. Atferdsforskning testing – Intravenøs selvadministrering Før atferdsmessige testing katetre skal skylles med 0,9% sterilt saltvann. Mus og deretter plassereD i operant kamre og koblet til infusjonen linjer og infusjonspumper. Active spak presser resultere i en 3,2 sek 18 pl legemiddelinfusjon kombinert med belysning av en stimulans lys. Hver spak trykk etterfølges av en 8 sek tid ut perioden som stimulans å lyse. Etter operant økten, er mus katetre spyles med heparinisert Ticarcillin løsning før de blir returnert til sine hjem buret. Mus har lov til å selv administrere for 3 påfølgende 2-timers økter på hver dose. Doser ble presentert i en tilfeldig rekkefølge for hver mus, som vist i den følgende del. Kateter patency vurderes daglig ved å påse at både saltvann og antibiotikaløsning kan spyles gjennom kateteret. I tillegg kan en ketamin / midazolam testen utføres som beskrevet i den vedlagte referanse 5. I korte trekk, tegn på anestesi som ubevegelighet innen 5 sekunder av en infusjon av 0.02 til 0,03 ml ketamin (15 mg / ml),eller midazolam (0,75 mg / ml) midazolam er bevis for en patent kateter 5.