إلى الوراء الإرواء وملء الأوعية الدموية التاجية الفأر كما التحضير للتصوير المقطعي بالكمبيوتر مايكرو
Summary
تصور من الأوعية التاجية أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لأمراض القلب والأوعية الدموية. نحن هنا وصف طريقة لperfusing الأوعية الدموية التاجية الفئران مع ظليل للأشعة مطاط السيليكون (Microfil)، تحضيرا للالدقيقة المحسوبة التصوير (μCT) التصوير المقطعي.
Abstract
تصور من الأوعية الدموية تزداد أهمية لفهم كثير من الحالات المرضية المختلفة. في حين أن العديد من التقنيات المتبعة لتصوير الأوعية الدموية، قليلة هي قادرة على تصور شبكة الأوعية الدموية ككل في حين تمتد إلى قرار يتضمن 1،2 السفن الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، العديد من تقنيات الصب الأوعية الدموية تدمير الأنسجة المحيطة بها، ومنع مزيد من التحليل للعينة 3-5. أسلوب واحد والتي تلتف حول هذه القضايا الصغيرة التصوير المقطعي (μCT). يمكن μCT التصوير تفحص بدقة <10 ميكرون، قادر على انتاج اعادة البناء 3D لشبكة الأوعية الدموية، ويترك الأنسجة السليمة للتحليل لاحقة (على سبيل المثال، الأنسجة وقياس الأشكال) 6-11. ومع ذلك، السفن التصوير بواسطة أساليب السابقين μCT فيفو يتطلب أن يكون ملء السفن مع مجمع ظليل للأشعة. على هذا النحو، تمثيل دقيق من الأوعية الدموية التي تنتجها التصوير μCT مرهونموثوق بها وكاملة ملء الأوعية. في هذا البروتوكول، وصفنا أسلوبا لملء الأوعية التاجية الماوس في التحضير لتصوير μCT.
وجود اثنين من التقنيات السائد لملء الأوعية الدموية في الشريان التاجي: في الجسم الحي عن طريق نضح إقناء؛ إدخال القنية ورجعية من الشريان الأبهر (أو فرع قبالة قوس الأبهر) 12-14، أو المجراة سابقا عن طريق نظام نضح Langendorff 15-17. هنا نحن تصف في الشريان الأورطي فيفو طريقة إقناء؛ إدخال القنية التي تم تصميمها خصيصا لضمان ملء جميع السفن. نستخدم ظليل للأشعة منخفضة اللزوجة مركب يسمى Microfil التي يمكن أن يروي من خلال أصغر السفن لملء جميع الشعيرات الدموية، وكذلك كلا الجانبين الشرياني والوريدي في شبكة الأوعية الدموية. وperfused السفن مع العازلة باستخدام نظام نضح الضغط، وشغل بعد ذلك مع Microfil. للتأكد من أن Microfil يملأ المراكب الصغيرة أعلى مقاومة، ونحن ligate فروع كبيرة emanatinز من الشريان الأورطي، والذي يحول Microfil في الشرايين التاجية. تعبئة مرة واحدة كاملة، لمنع طبيعة مرونة من أنسجة القلب من الضغط Microfil من بعض السفن، ونحن ligate الوصول الرئيسية مخارج الأوعية الدموية فورا بعد ملء. ولذلك، تم تحسين تقنية لدينا ملء كاملة والاحتفاظ بها إلى أقصى حد من وكيل تعبئة، مما يتيح تصور للشبكة كاملة الأوعية الدموية التاجية – الشرايين، والشعيرات الدموية، والأوردة على حد سواء.
Protocol
Discussion
أنسجة القلب لديه الطلب مرتفع جدا الأيضية، ولذلك يحتاج الى امدادات ثابتة من المواد المغذية والأكسجين من الدم الذي ألقاه الأوعية الدموية التاجية. يمكن أن أمراض الأوعية التاجية، والتي تقلل وظيفة القلب بسبب تضيق وانسداد الأوعية، يؤدي إلى نقص الأكسجين ونقص تروية الأنسج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور كيلي ستيفنز للمحاكمات الأولى للبروتوكول، والدكتور مايكل سيمونز، والدكتور Hauch كيب، وأعضاء من كل من المختبرات من أجل مناقشة عامة.
هذا العمل هو الدعم من خلال المنح والمعاهد الوطنية للصحة HL087513 HL094374 P01.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | BD-309602 | |
| 1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles | Becton Dickinson | BD-309306 | |
| 2″ x 2″ Gauze pads | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾” Angiocath IV catheter | Becton Dickinson | BD-381112 | |
| 26G ½”gauge needles | Becton Dickinson | BD-305111 | |
| Adenosine | Sigma | A9251 | 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine) |
| Angled Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile | Cardinal Health | C15055-006 | |
| Curved Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Dissecting stereoscope and light source | Nikon | NA | NA |
| Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches | Cole-Parmer | YO-10915-12 | Filled with tar for pinning down the mouse |
| Fine Curved Forceps | Aesculap | FD281R | Need two |
| Heparin, 5000 U/ml stock | APP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-047-10 | 1:100 dilution in water |
| KCl | Fisher | P217 | Saturated solution in H2O |
| Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock | Fort Dodge, Overland Park, KS, USA | NDC 0856-2013-01 | Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline |
| Microfil | Flow Tech | MV-122 (yellow). Other color options are also available. | Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed |
| Non-sterile Suture: 6-0, braided silk | Harvard Apparatus | 723287 | |
| Papaverine | American Regent Inc. | NDC 0517-4010-01 | 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine) |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Prepared as 4% solution |
| Perfusion Apparatus | See figure 2 | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock | Lloyd Labs | NADA #139-236 | Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline |
References
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
- Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
- Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
- Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
- Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
- Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
- Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
- Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
- Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
- Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
- Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
- Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
- Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts–technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
- Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
- Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
- Quintana, L., Sharpe, J. . Optical projection tomography of vertebrate embryo development. , 586-594 (2011).
- Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
- Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
- Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
- Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
- Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
- Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
- Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
- Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
- Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
- Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
- Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. , 254-441 (2010).
