Хроматин иммунопреципитации (чип) использование Drosophila Ткани
Summary
Недавно высокой пропускной последовательности технологий значительно увеличило чувствительность Хроматин иммунопреципитации (чип) эксперимент и побудило его применения с использованием очищенных клеток или расчлененные ткани. Здесь мы очертить метод использовать ChIP технику<em> Drosophila</em> Ткани, которая может решить эндогенного состояния хроматина в хорошо изученных биологических системах.
Abstract
Эпигенетика остается быстро развивающейся области исследований, которые, как состояние хроматина способствует дифференциальной экспрессии генов в различных типах клеток на разных стадиях развития. Эпигенетической регуляции способствует широкий спектр биологических процессов, в том числе дифференцировки клеток в процессе эмбрионального развития и гомеостаза в зрелом возрасте. Важнейшую стратегию в эпигенетические исследования является изучение того, как различные модификации гистонов хроматина и факторы регулируют экспрессию генов. Для решения этой проблемы Хроматин иммунопреципитации (чип) широко используется для получения снимков связаны с разными факторами ДНК в клетках интерес.
ChIP техника обычно используется культуре клеток в качестве исходного материала, который можно получить в изобилии и однородности для получения воспроизводимых данных. Однако, есть несколько предостережений: во-первых, условия для роста клеток в чашке Петри отличается от того, в естественных условиях, таким образом, можетне отражают эндогенный состояние хроматина клеток в живом организме. Во-вторых, не все типы клеток может быть культурным бывших естественных условиях. Есть лишь ограниченное число клеточных линий, от которых люди могут получить достаточно материала для чипов анализа.
Здесь мы опишем способ сделать ChIP эксперимент с использованием дрозофилы тканей. В качестве исходного материала рассечена тканей у живого животного, таким образом, можно точно отражают эндогенный состояние хроматина. Адаптации этого метода с различными типами тканей позволит исследователям для решения гораздо более биологически значимых вопросов, касающихся эпигенетической регуляции естественных условиях в 1, 2. Сочетание этого метода с высокой пропускной последовательности (Chip-далее) в дальнейшем позволит исследователям получить эпигеномном ландшафта.
Protocol
Discussion
Универсальность ChIP анализа обсуждаются в этот протокол может быть использован на различных тканях, что дает возможность изучить состояние хроматина в биологически соответствующей системы. ChIP экспериментов с использованием клеток из культуры системы удобно проводить, потому что бол?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить лаборатории доктора Кеджи Чжао (NIH / NHLBI) за их помощь в обеспечении последовательности результатов. Мы также хотели бы поблагодарить УСК проект генома для использования генома браузер наглядно отображается последовательность чтения.
Эта работа была поддержана Путь R00HD055052 NIH на премию независимости и R01HD065816 из NICHD, Люсиль Parkard Фонда и Университета Джонса Хопкинса запуск финансирования для XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
Riferimenti
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
