Lateral Diffusion og exocytose af membranproteiner i dyrkede neuroner vurderes ved hjælp af Fluorescens Recovery og Fluorescens-tab fotoblegning

Summary

Denne rapport beskriver anvendelsen af ​​levende celler billeddannelse og photobleach teknikker til bestemmelse af overfladen ekspression transportveje og handel kinetik eksogent udtrykt, pH-følsom GFP-mærkede proteiner til plasmamembranen af ​​neuroner.

Abstract

<p class="jove_content"> Membranproteiner, såsom receptorer og ionkanaler undergår aktiv handel i neuroner, som er stærkt polariserede og morfologisk kompleks. Dette rettet handel er af afgørende betydning at levere, opretholde eller fjerne synaptiske proteiner.</p><p class="jove_content"> Super-ekliptika pHluorin (SEP) er et pH-følsomt derivat af EGFP der er blevet omfattende anvendt til levende celler billeddannelse af plasma membranproteiner^1-2. Ved lav pH, aftager protonering af SEP foton-absorption og eliminerer fluorescensemission. Da de fleste intracellulære handel begivenheder forekommer i rum med lav pH, hvor september fluorescens overskygget, fluorescenssignalet fra Sep-mærkede proteiner er overvejende fra plasmamembranen, hvor SEP udsættes for en neutral pH ekstracellulære miljø. Når den lyser ved høj intensitet september, ligesom alle fluorescerende farvestof, er uigenkaldeligt lysbeskadiget (Lysbleget)^3-5. Vigtigt, fordi lav pH slukker foton absorption, kun overflade udtrykt september kan Lysbleget mens intracellulær september er upåvirket af den høje intensitet belysning^6-10.</p><p class="jove_content"> FRAP (fluorescens bedring efter fotoblegning) af SEP-mærkede proteiner er en praktisk og effektiv metode til vurdering af protein dynamik på plasmamembranen. Når fluorescens mærkede proteiner er Lysbleget i en region af interesse (ROI) nyttiggørelse i fluorescens opstår på grund af flytning af ubleget SEP-mærkede proteiner i bleget regionen. Dette kan forekomme via lateral diffusion og / eller fra exocytose af ikke-Lysbleget receptorer leveres enten<em> De novo</em> Syntese eller genanvendelse (se figur 1). Fraktionen af ​​immobile og mobile protein kan bestemmes og mobilitet og kinetikken af ​​diffunderbart fraktion kan interrogeres under basale og stimulerede betingelser, såsom agonist anvendelse eller neuronale aktivering stimuli, såsom NMDA og KCl anvendelse^8,10.</p><p class="jove_content"> Vi beskriver fotoblegemidler metoder, der skal selektivt at visualisere inddrivelse af fluorescens tilskrives exocytose. Kort fortalt er en ROI Lysbleget gang som med standard FRAP protokoller, efterfulgt, efter en kort genvinding, ved gentagen blegning af de flankerende regioner. Denne "FRAP-flip" protokol, udviklet i vores laboratorium, har været brugt til at karakterisere AMPA receptor handel på dendritiske pigge¹⁰, Og er anvendelig til en bred vifte af handel undersøgelser for at evaluere intracellulære handel og eksocytose.</p>

Protocol

1. Cell Culture, viral transduktion, og proteinekspression Kultur høj densitet hippocampale neuroner fra embryonisk dag 18 (E18) rotteunger på poly-L-lysin-overtrukne dækglas for 14-25 dage in vitro (DIV). 6-24 timer forud for levende forsøgene transducere celler med attenueret Sindbis virus indeholdende membranprotein af interesse, mærket med super-ekliptika pHluorin (SEP). Tilføje pseudovirion-holdige medium direkte til dækglasset indeholdende 1 ml af konditionerede medier og returneres til kulturen inkubator. Titeren og tid for proteinekspression efter viral transduktion vil variere afhængigt af virus batch og bør bestemmes for hvert parti før påbegyndelse levende celle eksperimenter. 2. FRAP-FLIP Live-Cell Imaging Udstyr set-up Overfør dækglas til billeddannelse kammer i et Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokal mikroskop.At minimere det elforbrug udsving i billedbehandling, sikre mikroskop er blevet tændt, med 100% laser output, i mindst 20 minutter før billeddannelse. Umiddelbart erstatte dyrkningsmediet med forvarmet (37 ° C) ekstracellulære optagelse opløsning indeholdende 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 15 mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH indstillet til 7,4 med NaOH) og anbringes i kammeret på den forvarmede trin (37 ° C) af Zeiss Axiovert. Sikre osmolariteten af ​​den ekstracellulære optagelsen opløsningen indstilles til inden for 10 mOsM din dyrkningsmedium. Forudsat ingen signifikant fordampning forekommer under tidsforløbet for eksperimentet, er denne CO 2 uafhængige opløsning egnet til korte eksperimenter (<10 timer). supplere med 1-2 mm natriumbicarbonat anbefales. definition af de billeddannende capture parametre første identificere en neuron, der udtrykker rekombinante protein interesse og bringe den i fokus. 63x olie modsatte erhverve et billede hele cellen ved hjælp 488 nm laserlys excitation lav lasereffekt. for at minimere fotoblegning, skal du bruge hurtig nominel hastighed (7-9) pixel opløsning (512-512) holde alt scanningshastighed <1 sekund. vælg del dendritceller til zoom fange ramme, indeholder roi (~ 1,5-2,5 x optisk zoom). hvor det er muligt, sikre synsfeltet flere processer, således målinger fra reference dendritter kan fås, afgøre, om non-specifik fotoblegning grund købet sker. juster filtre, pinhole, scan detektor gevinst sætte maksimal fluorescens minimal laser excitation, men begrænset mætning. stor pinhole diameter anbefales maksimere foton samling (2 um egnet pigge ternære dendritter). detektoren gain være stærk nok detektere små trin,sådan, allerførste billeder, før ikke overvinde 10% mættede pixels. gemme denne konfiguration anvendes præ-> Figur 1. Skematisk af hovedpersonerne i FRAP vs FRAP-flip protokoller Denne skematiske viser resultaterne af en regelmæssig FRAP versus en 'FRAP-flip "protokol, anvendelse af Sep-mærkede receptorer. Fluorescens opsving i traditionelle FRAP er vist på venstre side. Målte fluorescens opsving i den centrale ROI tilskrives en kombination af lateral diffusion f ikke Lysbleget SEP-mærkede receptorer uden for Lysbleget ROI og insertion af receptorer ved genbrug og / eller de novo eksocytose i den dendritiske akslen. Derimod gentagne Lysbleget af den flankerende ROIs illustreret i højre side viser, hvordan denne modificeret «FRAP-flip 'protokol tavshed opsving på grund af lateral diffusion. Som sådan kan en vilkårlig målt fluorescens opsving henføres til direkte indsættelse i ROI. Figur 2.Insertion af SEP-GluA2 i plasmamembranen på dendritiske akslen A) En hippocampale neuroner udtrykker SEP-GluA2 selektivt Lysbleget langs en ​​region af dendritceller. Den skematiske illustrerer området af dendritceller, som er afbildet, medens den øvre venstre panel fremhæver ROI'er der er udvalgt til fotoblegning. Det store hvide indrammede areal blev bleget en gang, efterfulgt af gentagne blegning af flankerende boxed regioner, der er fremhævet med dobbelt ledelse blå pile. Dette panel viser dendritceller før fotoblegning. Den røde pil viser den målte ROI, vist i stor forstørrelse i de nederste paneler. B) viser fluorescensintensiteten i det målte ROI over tidsforløbet for eksperimentet afbildet som grå niveau i ROI (ikke normaliseret). Den sorte pil fremhæve tidspunkterne af den oprindelige photobleach og grønne pil indikerer begyndelsen af ​​den repetitive fotoblegning. Df viser the stigning i fluorescens observeret i løbet af tilbagebetalingsperioden, på grund af indsættelse af SEP-GluA2 i dendritiske akslen. Efterfølgende lav pH og pH 7,4 + NH4Cl vaskninger bekræfte, at den genvundne fluorescens angår overfladen udtrykte receptorer. Figur 3. Genbrug & lateral diffusion vs Genvinding af SEP-GluK2 på dendritiske akslen efter cyclohexamid behandling A) En hippocampus neuron udtrykker SEP-GluK2, selektivt Lysbleget med parallel FRAP og 'FRAP-flip' recovery-protokoller, der udføres sammen separat dendritiske ROIs. Dette neuron blev underkastet forbehandling med cyclohexamid, at blokere proteinsyntese (2 timer ved 200 ug / ml). Den skematiske illustrerer området af dendritceller, som er afbildet, medens den venstre panel fremhæver ROI'er der er udvalgt til fotoblegning. The stor hvid indrammede areal blev bleget en gang, efterfulgt af gentagne blegning af flankerende boxed regioner, af den lavere dendritceller eneste, fremhævet med dobbelt hovede blå pile. Dette panel viser dendriterne før fotoblegning. Røde pile fremhæve ROIs vist i stor forstørrelse i B), der viser fluorescens opsving i traditionelle FRAP versus 'FRAP-flip' protokol. Sammenligninger af niveauer af fluorescens-intensiteten i den sene fase af genvinding (tredje panel) viser bidrag lateral diffusion og genvinding versus genvinding alene. C) viser fluorescensintensiteten i det målte ROI'er over tidsforløbet for eksperimentet afbildet som normaliseret intensitet værdier. Den sorte pil fremhæve tidspunkterne af den oprindelige photobleach og grønne pil indikerer begyndelsen af ​​den repetitive fotoblegning. Bf rec angiver forbigående opsving på grund af receptor genbrug, bestemmes ud fra FRAP / FLIP dendritceller, mens dfdiff måler bidrag lateral diffusion af SEP-GluK2 i dendritiske akslen i 'FRAP kun' ROI. Den kortvarige stigning efterfulgt af en gradvis nedgang i signalet, der svarer til nedslidt af tilgængelige receptorer som et resultat af cyclohexamid behandling. Den efterfølgende lav pH og pH 7,4 + NH4Cl vaskninger bekræfte, at den genvundne fluorescens angår overfladen udtrykte receptorer.

Discussion

Vi beskriver en innovativ strategi til at visualisere de komponenter plasmamembranprotein menneskehandel. Den kombinatoriske fremgangsmåde fotoblegning teknikker med SEP-mærket protein muliggør selektiv plasmamembran indsættelse begivenheder, der skal vurderes. Ved løbende at fotoblegning de membranproteiner i flankerende regioner under genopretning, vurderer 'FRAP-flip' metode bidrag af vesikulær menneskehandel til fluorescens opsving. Denne nye fremgangsmåde giver mulighed for direkte optagelse af protein membraninsertion, så både antallet af sub-rum, hvis inddrivelsen er observeret, og amplituden af ​​opsvinget (bf) ved steady state, der skal fastlægges. Yderligere sammenligning af FRAP med og uden FLIP tillader andelen af ​​genvinding tilskrives lateral diffusion beregnes.

Desuden i det samme eksperiment, kan områder af ikke-Lysbleget dendritceller stødende op til de flankerende Lysbleget regioner værekvalitativt vurderet under opsvinget, fluorescens tab observeret i disse regioner vil være på grund af lateral diffusion af Lysbleget receptorer i disse ikke-Lysbleget segmenter af dendritceller.

Denne selektive fotoblegning protokol kan anvendes til at undersøge en række cellulære handel processer, såsom kendetegnende excocytosis i plasmamembranen i definerede underområde (f.eks dendritter eller udløberne) eller til vurdering bidrag lateral diffusion vs insertion ved udførelse parallelle FRAP og 'FRAP -flip "protokoller langs hosliggende dendritter (fig. 3).

Klart, at mens specifikke retningslinjer er blevet forelagt, vil hver Lab skal optimere de billeddannende parametre efter specifikke prøver og udstyr. Vigtigt, at alle overflade-receptorer i ROI skal være Lysbleget, uafhængigt af z-aksen brændplanet, men uden signifikant fototoksisk skade eller ikke-specifik fotoblegning. OsERS bør udvise forsigtighed, når de forsøger denne protokol på celle-Soma, som den høje andel af relativt lave pH intracellulære rum typisk resulterer i høj baggrundsfluorescens i disse regioner. Desuden, mens vi har vist, hvordan denne teknik kan anvendes på forskellige måder, før påbegyndelse af selektive fotoblegemidler eksperimenter på en ny september-mærket konstruere, anbefaler vi, at en første karakterisering af de mærkede receptorer først udføres, som beskrevet af Ashby et al ^2.

Alt i alt, denne metode er en kraftfuld og alsidig tilpasning af standarden FRAP-protokollen, der muliggør indsættelse begivenheder i plasmamembranen, der skal evalueres i nær realtid.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
24mm glass coverslips	VWR International	631-0161
Poly-l-lysine	Sigma	P2636	1mg/ml in borate buffer to coat coverslips
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% in neuronal plating and feeding medium
Penicillin Streptomycin	Sigma	P0781	1% in neuronal plating and feeding medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM in plating/feeding medium
Horse Serum	Biosera	DH-291H	10% in neuronal plating media only
pSIN ReP5 cloning vector	Invitrogen	K75001	For Sindbis virus production
LSM510 META confocal system	Zeiss
Image J Software	NIH		open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/