Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Summary

Este relatório descreve a utilização de imagens de células vivas e técnicas photobleach para determinar a expressão de superfície, as vias de transporte e de cinética de tráfico de exogenamente expressa, GFP sensível ao pH proteínas na membrana plasmática dos neurónios.

Abstract

<p class="jove_content"proteínas de membrana>, como receptores e canais iônicos sofrem tráfico ativo em neurônios, que são altamente polarizada e morfologicamente complexo. Este tráfico direcionado é de fundamental importância para proporcionar, manter ou eliminar as proteínas sinápticas.</p><p class="jove_content"> Super-eclíptica pHluorin (SEP) é um derivado sensível ao pH de EGFP, que tem sido extensivamente utilizado para imagens de células vivas de proteínas de membrana de plasma^1-2. A um pH baixo, protonação de setembro diminui a absorção de fotões e elimina a emissão de fluorescência. Como os eventos de tráfico mais intracelulares ocorrer em compartimentos com pH baixo, onde setembro de fluorescência é eclipsada, o sinal de fluorescência a partir de SEP-etiquetados proteínas é predominantemente a partir da membrana plasmática, onde o setembro é exposto a um ambiente de pH neutro extracelular. Quando iluminado em setembro de alta intensidade, como qualquer corante fluorescente, é irreversível fotodanificada (Foto-descoloração)^3-5. Importante, pois o pH baixo sacia absorção de fótons, apenas a superfície expressa setembro pode ser Foto-descoloração enquanto setembro intracelular é afetado pela iluminação de alta intensidade^6-10.</p><p class="jove_content"> FRAP (recuperação de fluorescência após fotobranqueamento) de SEP-etiquetados proteínas é uma técnica conveniente e eficiente para a avaliação dinâmica de proteínas na membrana plasmática. Quando as proteínas fluorescentes são etiquetados Foto-descoloração em uma região de interesse (RDI) a recuperação da fluorescência ocorre devido ao movimento de proteínas cruas SEP-etiquetados para a região branqueada. Isto pode ocorrer através de difusão lateral e / ou a partir de exocitose de não-Foto-descoloração receptores fornecido por<em> De novo</em> Síntese ou de reciclagem (ver fig. 1). A fracção de proteína imóvel e móvel pode ser determinada ea mobilidade e cinética da fracção difusível pode ser interrogado em condições basais e estimuladas tais como aplicação de estímulos de activação agonista ou neuronais, tais como NMDA ou aplicação de KCl^8,10.</p><p class="jove_content"> Nós descrevemos técnicas fotobranqueamento concebidos para seletivamente visualizar a recuperação da fluorescência atribuível a exocitose. Resumidamente, um ROI é Foto-descoloração uma vez como com os protocolos padrão FRAP, seguido, após uma breve recuperação, por repetitivo de branqueamento das regiões flanqueadoras. Este protocolo "FRAP-FLIP", desenvolvido em nosso laboratório, tem sido usado para caracterizar o tráfico de receptor AMPA em espinhas dendríticas¹⁰, E é aplicável a uma ampla gama de estudos de tráfico para avaliar o tráfico intracelular e exocitose.</p>

Protocol

1. Cultura de Células, Transdução Viral, e expressão de proteínas Neurónios do hipocampo de cultura de alta densidade a partir de embrionárias filhotes dia 18 (E18) de ratos sobre lamelas de poli-L-lisina-revestidos de vidro para 14-25 dias in vitro (DIV). 6-24h antes para as experiências vivos, as células transduzir com atenuada do vírus Sindbis que contêm a proteína de membrana de interesse, marcado com o pHluorin super-elíptica (SEP). Adicionar o meio contendo pseudo-directamente para a lamela contendo 1 ml de meio condicionado e voltou para a incubadora de cultura. O título e tempo para a expressão da proteína após a transdução virai irá variar dependendo do lote de vírus e deve ser determinada para cada lote antes de iniciar as experiências de células vivas. 2. FRAP-FLIP imagens de células vivas Equipamento set-up Transferir a lamela para a câmara de imagem de um microscópio Zeiss Axiovert LSM META 510 confocal.Para minimizar flutuações de energia durante o exame, certifique-se o microscópio foi ligado, com saída do laser de 100%, por pelo menos 20 minutos antes da imagem. Imediatamente, substituir o meio de cultura com pré-aquecido (37 ° C) solução de gravação extracelular contendo 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucose, 1,5 mM de CaCl2, 1,5 mM de MgCl2, 20-25 mM de HEPES (pH ajustado para 7,4 com NaOH) e colocar a câmara sobre a fase de pré-aquecido (37 ° C) do Axiovert Zeiss. Assegurar a osmolaridade da solução de gravação extracelular é ajustada para dentro 10 mOsM do seu meio de cultura. Desde que não evaporação significativa ocorre durante o timecourse do experimento, esta solução 2 CO independente é adequado para experiências curtos (menos de 10 horas). A suplementação com 1-2 mM de bicarbonato de sódio é recomendada. Definir os parâmetros de captura de imagem Em primeiro lugar, identificar um neurônio expressar a pro recombinantetein de interesse e trazê-lo em foco. Com um óleo 63X opôs, adquirir uma imagem de toda a célula utilizando excitação de luz laser em 488nm potência do laser de baixa. Para minimizar a fotodegradação, use uma velocidade nominal (7-9) e pixels de resolução baixa (512-512), mantendo velocidade de digitalização total <1 segundo. selecione uma parte de dendrite imagem e zoom para capturar um quadro que contém o roi (~ 1,5-2,5 x óptico). sempre possível, assegurar campo visão vários processos modo as medições dendrites referência pode ser obtido, determinar se não específica fotobranqueamento devido à aquisição está a ocorrer. ajuste os filtros, pinhole, velocidade varredura ganho detector fluorescência permitir máxima excitação laser mínima, mas com saturação limitado. diâmetro grande orifício é recomendado, maximizar recolha do fotão (2μm adequado coluna dendritos ternárias). deve suficientemente forte detectar pequenas incrementos fluorescência,de tal imagens muito primeiro lugar, antes da ultrapassar 10% pixels saturados. guardar esta configuração usado pré-> Figura 1. Esquemática dos princípios da FRAP vs FRAP-FLIP protocolos Este esquema ilustra os resultados de um protocolo FRAP regulares contra um "FRAP-FLIP", usando SEP-tag receptores. Recuperação de fluorescência em FRAP tradicional é mostrado na lado esquerdo. Medido de recuperação de fluorescência na ROI central é atribuída a uma combinação de difusão laterais não-f Foto-descoloração receptores SEP-marcados a partir de fora da ROI Foto-descoloração e inserção de receptores por meio de reciclagem e / ou exocitose de novo para o eixo dendrítica. Por outro lado, o Foto-descoloração repetitivo das ROIs acompanhamento ilustrado na lado direito, mostra como "FRAP-FLIP" este protocolo modificado de recuperação silêncios devido à difusão lateral. Como tal, qualquer recuperação fluorescência medida pode ser atribuída a inserção directa no ROI. Figura 2.A inserção de setembro-GluA2 para a membrana plasmática no eixo dendrítica A) Um neurônio hipocampo expressar SEP-GluA2, seletivamente Foto-descoloração ao longo de uma região de dendrite. O esquema ilustra a região de dendrite que foi fotografada, enquanto que o painel do lado esquerdo superior destaca a ROIs que foram seleccionados para fotobranqueamento. A área branca grande caixa foi branqueada uma vez, seguido pelo repetitivo branqueamento das regiões flanqueadoras em caixa, destacados com duas cabeças setas azuis. Este painel mostra a dendrite antes de fotodegradação. A seta indica o vermelho ROI medido, mostrado na ampliação elevada nos painéis inferiores. B) mostra a intensidade de fluorescência na ROI medido ao longo do tempo da experiência, traçada como o nível de cinzento na ROI (não normalizada). A seta preta realçar o instante do photobleach inicial e seta verde indica o início do fotobranqueamento repetitivo. Af indica thaumento na fluorescência e observado ao longo do período de recuperação, devido à inserção de setembro-GluA2 no eixo dendrítica. PH baixo subsequente e pH 7,4 + NH4 lavagens Cl confirmar que a fluorescência recuperado relaciona-se com tona receptores expressos. Figura 3. Reciclagem e Reciclagem vs laterais difusão do SEP-GluK2 no eixo dendrítica após o tratamento ciclohexamida A) Um neurônio hipocampo expressar SEP-GluK2, seletivamente Foto-descoloração com FRAP paralelo e protocolos "FRAP-FLIP" de recuperação realizadas ao longo ROIs dendrítica separado. Este foi sujeito a neurónio pré-tratamento com ciclohexamida, para bloquear a síntese de proteínas (2 horas a 200 ug / ml). O esquema ilustra a região de dendrite que foi fotografada, enquanto que o painel do lado esquerdo destacando a ROIs que foram seleccionados para fotobranqueamento. The área branca grande encaixotado foi branqueada uma vez, seguido por repetitiva de branqueamento das regiões flanqueadoras encaixotadas, da parte inferior da dendrite apenas, em destaque com duas pontas setas azuis. Este painel mostra os dendritos antes de fotodegradação. As setas vermelhas destacar o ROIs mostrado em alta ampliação em B) ilustrando a recuperação de fluorescência em FRAP tradicional versus o protocolo "FRAP-FLIP". Comparações de níveis de intensidade de fluorescência na fase tardia da recuperação (painéis terceiros) mostram a contribuição da difusão lateral e reciclagem contra a reciclagem sozinho. C) mostra a intensidade de fluorescência na ROIs medido ao longo do tempo da experiência, representados como intensidade normalizada valores. A seta preta realçar o instante do photobleach inicial e seta verde indica o início do fotobranqueamento repetitivo. Af rec indica a recuperação transitória devido à reciclagem receptor, determinado a partir do dendrito FRAP / FLIP enquanto Afdiff mede a contribuição da difusão lateral do SEP-GluK2 no eixo dendrítica no 'FRAP apenas "ROI. O aumento transiente é seguido por um declínio gradual no sinal, correspondente ao funcionamento para baixo de receptores disponíveis como resultado do tratamento ciclohexamida. O pH baixo e subsequente pH 7,4 + NH4 lavagens Cl confirmar que a fluorescência recuperado relaciona-se com tona receptores expressos.

Discussion

Nós descrevemos uma estratégia inovadora para visualizar os componentes do plasma tráfico proteína de membrana. A abordagem combinatória de fotodegradação técnicas com a proteína SEP-tag permite seletivamente eventos de inserção da membrana plasmática para ser avaliado. Continuamente fotobranqueamento as proteínas da membrana em regiões acompanhamento durante a recuperação, o método 'FRAP-FLIP "avalia a contribuição do tráfico vesicular para a recuperação de fluorescência. Esta nova abordagem permite a gravação directa de inserção de proteína de membrana, permitindo que tanto o número de sub-compartimentos em que a recuperação é observado e da amplitude da recuperação (Af), no estado estacionário a ser determinado. Além disso, a comparação de FRAP com e sem FLIP permite a proporção de recuperação atribuível a difusão lateral de ser calculados.

Além disso, na mesma experiência, as regiões de não-Foto-descoloração dendrite adjacente às regiões flanqueadoras Foto-descoloração pode seravaliados qualitativamente durante a recuperação, a perda de fluorescência observada nestas regiões será devido à difusão lateral dos receptores Foto-descoloração para esses segmentos não-Foto-descoloração do dendrito.

Este protocolo selectiva fotobranqueamento pode ser utilizada para investigar uma variedade de processos celulares, tais como o tráfico caracterizando excocytosis na membrana plasmática em subáreas definidos (por exemplo, dendritos ou espinhas) FRAP ou avaliar a contribuição da inserção lateral, difusão através da realização de vs FRAP paralelo e ' protocolos-FLIP 'ao longo dendritos adjacentes (Fig. 3).

É evidente que, embora as orientações específicas foram apresentados, cada laboratório será necessário otimizar os parâmetros de imagem de acordo com amostras e equipamentos específicos. Importante, todos os receptores de superfície no ROI precisa ser Foto-descoloração, independente do plano z eixo focal, mas sem danos fototóxico significativa ou não-específica fotobranqueamento. NosERS deve ter cautela ao tentar este protocolo na soma das células, como a elevada percentagem de compartimentos de pH relativamente baixos intracelulares normalmente resulta em fluorescência de fundo de alta nestas regiões. Além disso, enquanto que tenhamos demonstrado como esta técnica pode ser aplicada em varia maneiras, antes de iniciar selectivos experiências fotobranqueamento sobre um novo SEP-etiquetados construir, aconselha que uma caracterização inicial dos receptores marcados é primeiro conduzido, tal como descrito por Ashby et ai ^2.

Em geral, este método é uma adaptação potente e versátil do protocolo FRAP padrão, permitindo que os eventos de inserção na membrana de plasma a ser avaliada em tempo real.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
24mm glass coverslips	VWR International	631-0161
Poly-l-lysine	Sigma	P2636	1mg/ml in borate buffer to coat coverslips
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% in neuronal plating and feeding medium
Penicillin Streptomycin	Sigma	P0781	1% in neuronal plating and feeding medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM in plating/feeding medium
Horse Serum	Biosera	DH-291H	10% in neuronal plating media only
pSIN ReP5 cloning vector	Invitrogen	K75001	For Sindbis virus production
LSM510 META confocal system	Zeiss
Image J Software	NIH		open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/