Cellules endothéliales co-culture de maturation de la médiation de l'homme les cellules souches embryonnaires à des cellules productrices d'insuline du pancréas dans une approche différenciation dirigée
Summary
La présente étude décrit une approche différenciation dirigée dans l'induction de la différenciation du pancréas de cellules souches embryonnaires humaines. D'une grande importance est le fait que des cellules endothéliales de co-culture de maturation de la médiation sur les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des progéniteurs pancréatiques en cellules exprimant l'insuline.
Abstract
Les cellules souches embryonnaires (ESC) ont deux caractéristiques principales: elles peuvent être indéfiniment propagées di vitro dans un état indifférencié et elles sont pluripotentes, ayant ainsi le potentiel de se différencier en plusieurs lignées. Ces propriétés font CES extrêmement attractif pour la thérapie cellulaire à base et les applications de traitement de régénération 1. Toutefois, pour son plein potentiel à réaliser les cellules doivent être différenciées en phénotypes matures et fonctionnelles, ce qui est une tâche ardue. Une approche prometteuse dans l'induction de la différenciation cellulaire est à suivre de près imiter le chemin de l'organogenèse dans le cadre in vitro. Le développement du pancréas est connu pour se produire dans des stades spécifiques 2, à commencer par l'endoderme, qui peut se développer dans plusieurs organes, y compris le foie et le pancréas. L'induction endoderme peut être obtenue par modulation de la voie nodale par addition de l'activine A 3 en combinaison avec plusieurs facteurs de croissance 4-7 </sup>. Cellules endodermiques définitives sont alors soumis à l'engagement du pancréas par inhibition de l'inhibition Sonic Hedgehog, qui peut être obtenu in vitro par addition d'Cyclopamine 8. La maturation du pancréas est médiée par plusieurs événements parallèles dont l'inhibition de la signalisation Notch; l'agrégation des progéniteurs pancréatiques en 3-dimensionnelles grappes; induction de la vascularisation; pour n'en nommer que quelques-uns. De loin le plus de succès dans la maturation in vitro de l'ESC dérivés des cellules progénitrices du pancréas ont été atteints par l'inhibition de la signalisation Notch par la supplémentation DAPT 9. Malgré son succès, il en résulte un faible rendement de l'phénotype mature avec des fonctionnalités réduites. Une zone moins étudié est l'effet de signalisation des cellules endothéliales dans la maturation du pancréas, ce qui est de plus en plus apprécié comme un facteur important qui contribue à la maturation in vivo des îlots pancréatiques 10,11.
L'étude actuelle explore un tel effet de endothelial de signalisation cellulaire dans la maturation de l'homme ESC dérivés des cellules progénitrices pancréatiques productrices d'insuline dans l'îlot des cellules semblables à. Nous rapportons un protocole multi-stade de différenciation dirigée où les CES de l'homme sont d'abord induite par l'activine vers l'endoderme A avec l'inhibition de la voie de la PI3K. Spécification de cellules pancréatiques endodermiques est réalisée par l'inhibition de la signalisation par Sonic Hedgehog cyclopamine avec l'induction rétinoïde par addition d'acide rétinoïque. La dernière étape de maturation est induite par la signalisation cellulaire endothéliale réalisée par une configuration co-culture. Alors que plusieurs cellules endothéliales ont été testés dans la co-culture, ici, nous présentons nos données avec des cellules de rat cardiaques microvasculaires endothéliales (RHMVEC), principalement pour la facilité de l'analyse.
Protocol
Discussion
Au cours du développement du pancréas, de différenciation des cellules pancréatiques sont en étroite proximité avec les cellules endothéliales de l'aorte; outre, les îlots pancréatiques sont densément vascularisé de promouvoir l'échange rapide de glucose dans le sang et les hormones des îlots de Langerhans. Compte tenu de ces faits, il n'est pas surprenant que les cellules endothéliales jouent un rôle important dans le processus d'organogenèse du pancréas. Bien que l'importance des c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le soutien de prix NIH Innovateur New DP2 116520 et ORAU Ralph Powe junior Prix Amélioration de la Faculté.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Concentrations |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Straragene | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
Table 2. Reagents and Kits.
Riferimenti
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