TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung<em> Vibrio cholerae</em> On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Summary

Eine schnelle Methode, um das Genom zu ändern<em> V. cholerae</em> Beschrieben. Diese Änderungen umfassen das Löschen von einzelnen Genen, Gen-Cluster und genomische Inseln sowie die Integration von kurzen Sequenzen (zB Promotorelemente oder Affinitäts-tag-Sequenzen). Das Verfahren basiert auf der natürlichen Transformation und FLP-Rekombination.

Abstract

Mehrere Methoden stehen zur Verfügung, um zu manipulieren bakteriellen Chromosomen ^1-3. Die meisten dieser Protokolle beruhen auf der Einbringung von konditional replizierende Plasmide (z. beherbergen pir-abhängigen oder temperaturempfindlichen Replikons ^1,2). Diese Plasmide sind in bakteriellen Chromosomen auf Homologie-vermittelte Rekombination integriert. Solche Insertions-Mutanten werden häufig direkt in der experimentellen Einstellungen verwendet. Alternativ kann Selektion auf Plasmid Exzision durch seinen Verlust gefolgt durchgeführt werden, die für Gram-negative Bakterien häufig der Zähler wählbare Levansucrase Enzyms durch die sacB Gen ⁴ codiert wird. Die Excision kann entweder wieder die vor dem Einsetzen Genotyp oder führen zu einem Austausch zwischen dem Chromosom und dem Plasmid-kodierten Kopie des modifizierten Gens. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass es zeitraubend ist. Das Plasmid muss zuerst geklont werden, sondern erfordert horizontalen Transfer in V. cholerae (höchstens n otably durch Paarung mit einem E. coli Donor-Stamm) oder künstliche Umwandlung der letzteren, und die Exzision des Plasmids ist zufällig und kann entweder wieder die anfängliche Genotyp oder erzeugen die gewünschte Modifikation, wenn kein positiver Selektion ausgeübt wird. Hier präsentieren wir eine Methode für die schnelle Manipulation der V. cholerae-Chromosom (s) ⁵ (Abbildung 1). Diese TransFLP Verfahren basiert auf der kürzlich entdeckten Chitin-vermittelte Induktion der natürliche Kompetenz in diesem Organismus ⁶ und anderen Vertreter der Gattung Vibrio wie V. basierend fischeri ^7. Natürliche Kompetenz ermöglicht die Aufnahme von freier DNA einschließlich PCR-generierten DNA-Fragmenten. Sobald aufgenommen, rekombiniert die DNA mit dem Chromosom bei Vorliegen einer minimalen von 250-500 bp der flankierenden homologen Bereich ^8. Einschließlich einen Selektionsmarker in-zwischen diesen flankierenden Regionen ermöglicht eine einfache Erkennung von häufig auftretenden Transformanten.

t "> Diese Methode kann für verschiedene genetische Manipulationen von V. cholerae verwendet werden und möglicherweise auch andere natürlich kompetente Bakterien. Wir bieten drei neue Beispiele, was man mit dieser Methode zusätzlich zu unseren bereits veröffentlichten Studie auf einzelne Gen-Deletionen und durchgeführt werden Neben der Affinität-tag-Sequenzen ^5. Mehrere Optimierungsschritte über die erste Protokoll von Chitin-induzierte natürliche Transformation ⁶ sind in diesem TransFLP Protokoll aufgenommen. Dazu gehören unter anderem der Austausch von Krabben Granatsplitter durch kommerziell erhältliche Chitin Flocken ^8, die Spende von PCR abgeleiteten DNA als transformierenden Materials ^9, und die Addition von FLP-Rekombination Zielstellen (FRT) ^5. FRT erlauben ortsspezifische Exzision des Selektionsmarkers durch die Rekombinase Flp ¹⁰ vermittelt.

Protocol

Die TransFLP Methode (Abbildung 1) durch drei verschiedene Ansätze exemplifiziert: I) die Deletion von zwei benachbarten Genen Virulenzeigenschaften V. cholerae (zB ΔctxAB), II) die Entnahme einer Pathogenitätsinsel (zB ΔVPI-1), und III) die Integration eines T7-RNA-Polymerase-abhängigen Promotorsequenz stromauf von einer Gen-von-Interesse, das anschließend erlaubt seinen künstliche Expression in dem jeweiligen Stamm Hintergrund (zB T7-tfox) (Abbildung 2).</stro…

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse der drei Beispiele sind in den 4 bis 6 gezeigt. Der erste Ansatz, der die Streichung der benachbarten Gene ctxA und ctxB soll. Gemeinsam codieren die wichtigsten Virulenzfaktor von V. cholerae, Cholera-Toxin. Wir entwickelten Oligonukleotiden zur TransFLP Verfahren wie oben beschrieben und gemäß 3. Die elterliche Stamm wurden die Zwischenschicht Stamm, die FRT-flankiert Antibiotikaresistenz Kassette in der ursprün…

Discussion

Die TransFLP oben beschriebenen Methode und anderswo ⁵ wurde ausgiebig in unserem Labor verwendet. Die Art der genetischen Manipulationen, die durchführbar sind, umfassen unter anderem: Deletion einzelner Gene und Gencluster, Deletion Genominseln (zB VPI-1), Insertion von Sequenzen stromaufwärts eines Gens von Interesse (z. B. Promotorsequenzen) und Einführen Sequenzen am Ende eines spezifischen Gens (zB Codierung Affinitätstags).

Ein Import Vorausse…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chitin flakes	Sigma	C9213	Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp)	Biorad	165-2100	Or comparable electroporators