TransFLP - 유 전적으로 수정하는 방법<em> 장염 cholerae</em> 자연 변화와 FLP-재조합에 근거
Summary
의 게놈을 수정하는 빠른 방법<em> V. cholerae</em>이 설명되어 있습니다. 이 수정 한 유전자, 유전자 클러스터와 게놈 섬뿐만 아니라 짧은 시퀀스 (예 : 프로모터 요소 또는 선호도 태그 시퀀스)의 통합의 삭제가 포함되어 있습니다. 방법은 자연의 변화와 FLP-재조합에 기반을두고 있습니다.
Abstract
몇 가지 방법이 박테리아 염색체 1-3 조작 할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 대부분은 (예 : PIR에 따라 달라 나 온도에 민감한 replicons에게 1,2을 품고) 조건 replicative의 plasmids의 삽입에 의존하고 있습니다. 이러한 plasmids은 호몰 로지로 인한 재조합에 따라 세균 염색체에 통합되어 있습니다. 이러한 insertional 돌연변이는 종종 직접 실험 설정에 사용됩니다. 또는 손실에 이어 플라스미드 절단에 대한 선택은 종종 sacB 유전자 넷으로 인코딩 된 카운터 선택 레반의 sucrase 효소에 의존 그람 음성 박테리아있는 수행 할 수 있습니다. 절단 중 하나 미리 삽입 유전자형 또는 염색체와 수정 된 유전자의 플라스미드 인코딩 복사본 사이의 교류의 결과를 복원 할 수 있습니다. 이 기법의 단점은 시간이 많이 걸리는 점입니다. 플라스미드는 먼저 복제 할 수 있습니다, 그것은 V.으로 수평 이동이 필요합니다 cholerae (대부분 N otably E.와 결합하여 대장균의 기증 부담) 또는 후자의 인공 변환 및 플라스미드의 절단은 임의입니다하거나 초기 유전자형을 복원하거나 더 긍정적 인 선택이 가해되지 않을 경우 원하는 수정을 만들 수 있습니다. 여기, 우리는 V.의 빠른 조작하기위한 방법을 제시 cholerae의 염색체 (들) 5 (그림 1). 이 TransFLP 방법은 같은 V.으로 속 장염의 유기체 6 다른 대표의 자연 능력의 최근에 발견 된 키틴로 인한 유도를 기반으로 fischeri 7. 자연 능력은 PCR 생성 된 DNA 조각을 포함한 무료 DNA의 이해 할 수 있습니다. 일단 차지하고, DNA가 일치하는 지역 8 측면을 노릴의 250-500 BP의 최소의 존재 주어진 염색체와 recombines. 이러한 측면을 노릴 지역에서 중간 선택 마커를 포함하면 자주 발생 transformants을 쉽게 감지 할 수 있습니다.
t는 ">이 방법은 V. cholerae의 다른 유전자 조작에 사용되며 잠재적으로 다른 자연적 능력이 박테리아 할 수 있습니다. 우리는 이전에 다음 ID로 출판 단일 유전자 삭제에 대한 연구와에 추가이 방법에 의해 수행 될 수있는 세 개 소설 예제를 제공합니다 연관성 태그 시퀀스 5 추가가. 키틴 유발 자연 변화 6의 초기 프로토콜에 관한 몇 가지 최적화 단계는이 TransFLP 프로토콜에 통합되어 있습니다.이 다른 사람들 사이에 상업적으로 이용 가능한 키틴 조각 8, PCR의 기부에 의한 게 껍질 조각의 교체를 포함 자료 9, FLP – 재결합 대상 사이트 (FRT) 5의 추가를 변형 등의 파생 DNA. FRT 사이트는 Flp recombinase (10)에 의해 중재 선택 마커의 사이트 감독 절단 할 수 있습니다.Protocol
Representative Results
Discussion
TransFLP 방법은 5 광범위하게 저희 연구실에서 사용 된 이상, 다른 곳에서 설명했다. 가능한 아르 유전자 조작의 종류는 다른 이들과 같습니다 : 하나의 유전자 및 유전자 클러스터의 삭제, 게놈 섬의 삭제 (예 : VPI-1) 관심 유전자 (예를 들어, 발기인 시퀀스)의 상류 시퀀스의 삽입과 삽입을 특정 유전자 (예를 들어, 인코딩 연관성 태그)의 끝 부분에 시퀀스.
<p class="jove_…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
나는 기술 지원을 위해 올가 드 수자 실바을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (SNSF) 부여 31003A_127029에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
Riferimenti
- Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
- Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
- Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
- De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
- Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
- Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
- Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. . Molecular Cloning: A laboratory manual. 1, (1989).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
- Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
- Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
- Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
- Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani, M., Kamruzzaman, J. J., Mekalanos, Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
- Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
- Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).
