Analyse unicellulaire des Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

Summary

Biofilms microbiens sont généralement constitués par des sous-populations distinctes de cellules spécialisées. Analyse unicellulaire de ces sous-populations nécessite l'utilisation de reporters fluorescents. Nous décrivons ici un protocole de visualiser et de contrôler plusieurs subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilms en utilisant la microscopie par fluorescence et la cytométrie en flux.

Abstract

La formation du biofilm est un attribut général à presque tous les ^1-6 bactéries. Lorsque les bactéries forment des biofilms, les cellules sont enfermés dans la matrice extracellulaire qui est le plus souvent constitué par les protéines et les exopolysaccharides, entre autres facteurs ^7-10. La communauté microbienne enfermé au sein du biofilm se montre souvent la différenciation des sous-populations distinctes de cellules spécialisées ^11-17. Ces sous-populations coexistent et font souvent preuve d'organisation spatiale et temporelle au sein du biofilm ^18-21.

La formation du biofilm dans les modèle Bacillus subtilis organisme exige la différenciation des sous-populations distinctes de cellules spécialisées. Parmi eux, la sous-population des producteurs de la matrice, responsable de produire et de sécréter la matrice extracellulaire du biofilm est essentiel pour la formation de biofilm ^11,19. Ainsi, la différenciation des producteurs de la matrice est une caractéristique de la formation de biofilms dans B. subtilis.

Nous avons utilisé des reporters fluorescents de visualiser et de quantifier la sous-population des producteurs de la matrice dans les biofilms de B. subtilis ^15,19,22-24. Concrètement, nous avons observé que la sous-population des producteurs de la matrice différencie en réponse à la présence d'auto-produit un signal extracellulaire surfactine ^25. Intéressant, surfactine est produit par une sous-population de cellules spécialisées différentes de la sous-population de producteurs de matrice ^{de 15.}

Nous avons détaillé dans le présent rapport l'approche technique nécessaire pour visualiser et de quantifier la sous-population des producteurs de la matrice et les producteurs dans les biofilms surfactine de B. subtilis. Pour ce faire, les journalistes fluorescents de gènes nécessaires à la production de la matrice et de la production surfactine sont insérés dans le chromosome de B. subtilis. Reporters ne sont exprimées que dans une sous-population de cellules spécialisées. Ensuite, les sous-populations peuvent êtrecontrôlée à l'aide de microscopie par fluorescence et la cytométrie de flux (voir fig 1).

Le fait que différentes sous-populations de cellules spécialisées au sein des communautés coexistent multicellulaires de bactéries nous donne une perspective différente sur la régulation de l'expression génique chez les procaryotes. Ce protocole traite de ce phénomène expérimentalement et il peut être facilement adapté à n'importe quel modèle de travail d'autre part, d'élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents hétérogénéité phénotypique au sein d'une communauté microbienne.

Protocol

1. Étiquetage B. subtilis et essai de formation de biofilm Amplifier par PCR de la région promoteur du gène d'intérêt. Nous montrons à titre d'exemple le clonage de P tapa, le promoteur des gènes responsables de la production de Tasa matrice protéique 26. Clone P tapa dans pkm008 vecteur (créé par le laboratoire Rudner, Harvard Medical School. Boston, Etats-Unis) (Fig. 2). Linéariser les plasmides par digestion enzymatiqu…

Discussion

Le fait que les communautés bactériennes montrent sous-populations de cellules exprimant ensemble spécifique de gènes preuves de la complexité des communautés microbiennes ^33,34. Ce protocole devrait aider à déterminer si l'expression de tout gène d'intérêt est limitée à une sous-population particulière de cellules spécialisées au sein de la communauté microbienne. La visualisation de ces sous-populations nécessite le développement de nouvelles techniques, parce que les méthodes tr…

Materials

Technique	Name of the reagent	Company	Catalog number
MSgg composition	potassium phosphate 5mM	Roth	6878
	MOPS 100mM	Sigma-Aldrich	M1254
	Magnesium chloride 2mM	Roth	2189.1
	Calcium chloride 700μM	Roth	A119.1
	Ferric chloride 50μM	Sigma-Aldrich	157740
	Zinc chloride 1μM	Applichem	A2076
	Thiamine 2μM	Sigma-Aldrich	74625
	Glycerol 0.5%	Roth	7533
	Glutamate 0.5%	Sigma-Aldrich	49621
	Tryptophan 50μg/ml	Sigma-Aldrich	T0254
	Phenylalanine 50μg/ml	Sigma-Aldrich	P2126
Cell fixation	Paraformaldehyde	Roth	0335
	Name of the equipment	Company	Catalog number
Sonication	Cell Sonicator	Bandelin	D-1000
Fluorescence Microscopy	Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000B
	Name of the software	Company	Catalog Number
Fluorescence Microscopy	AsaF	Leica
Flow cytometry	FCASDiva	BD
Flow cytometry	FlowJo	Treestar