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Immunologia e infezioni

एकल कक्ष का विश्लेषण बेसिलस subtilis प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और फ्लो का उपयोग Biofilms

Published: February 15, 2012
doi:
10.3791/3796
, , ,
1Institute for Molecular Infection Biology (IMIB),University of Würzburg

Summary

माइक्रोबियल biofilms विशेष कोशिकाओं की अलग subpopulations द्वारा आम तौर पर गठन कर रहे हैं. इन उप – जनसंख्या की एकल कोशिका विश्लेषण फ्लोरोसेंट पत्रकारों के उपयोग की आवश्यकता है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए कल्पना और कई subpopulationswithin की निगरानी<em> बी. subtilis</em> प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry का उपयोग biofilms.

Abstract

Biofilm गठन लगभग सभी बैक्टीरिया 1-6 के लिए एक सामान्य विशेषता है. जब बैक्टीरिया biofilms रूप कोशिकाओं कि ज्यादातर और प्रोटीन exopolysaccharides द्वारा गठित अन्य 7-10 कारकों के बीच, बाह्य मैट्रिक्स में encased है. माइक्रोबियल समुदाय में biofilm भीतर अक्सर encased के विशेष कोशिकाओं 11-17 की अलग subpopulation की भिन्नता से पता चलता है. इन उप – जनसंख्या में एक समय में होना और अक्सर 18-21 biofilm भीतर स्थानिक और लौकिक संगठन दिखा.

मॉडल जीव बेसिलस subtilis में biofilm गठन विशेष कोशिकाओं की अलग subpopulations के भेदभाव की आवश्यकता है. उनमें से,. मैट्रिक्स निर्माता, उत्पादन और biofilm के बाह्य मैट्रिक्स छिपाना जिम्मेदार subpopulation biofilm गठन 11,19 के लिए आवश्यक है. इसलिए, मैट्रिक्स उत्पादकों के भेदभाव बी में biofilm गठन की एक बानगी है subtilis.

हम फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से इस्तेमाल किया है बी के biofilms में कल्पना और मैट्रिक्स उत्पादकों की subpopulation यों 15,19,22-24 subtilis. Concretely, हमने देखा है कि मैट्रिक्स उत्पादकों की subpopulation स्वयं का उत्पादन कोशिकी संकेत 25 surfactin की उपस्थिति के जवाब में अंतर है. दिलचस्प है, surfactin विशेष मैट्रिक्स पन्द्रह उत्पादकों के subpopulation से अलग कोशिकाओं के subpopulation द्वारा निर्मित है.

हम इस तकनीकी कल्पना और बी subtilis की biofilms भीतर मैट्रिक्स उत्पादकों और surfactin उत्पादकों के subpopulation यों आवश्यक दृष्टिकोण रिपोर्ट में विस्तृत है. ऐसा करने के लिए, मैट्रिक्स उत्पादन और surfactin उत्पादन के लिए आवश्यक जीन के फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से बी. के गुणसूत्र में डाला जाता है subtilis. रिपोर्टर केवल विशेषज्ञता कोशिकाओं के एक subpopulation में व्यक्त कर रहे हैं. फिर, उप – जनसंख्या हो सकते हैंप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry (चित्र 1 देखें) का उपयोग पर नजर रखी.

तथ्य यह है कि विशेष कोशिकाओं के विभिन्न subpopulations बैक्टीरिया की multicellular समुदाय के भीतर एक समय में होना हमें prokaryotes में जीन अभिव्यक्ति के नियमन के बारे में एक अलग परिप्रेक्ष्य देता है. यह प्रोटोकॉल इस घटना प्रयोगात्मक पते और यह आसानी से किसी भी अन्य काम कर रहे मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, आणविक एक सूक्ष्म समुदाय प्ररूपी विजातिता के भीतर अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट.

Protocol

1. लेबल बी. subtilis और biofilm गठन परख पीसीआर द्वारा ब्याज की जीन के प्रमोटर क्षेत्र बढ़ाना. हम उदाहरण के रूप में पी tapa, TasA मैट्रिक्स 26 प्रोटीन के उत्पादन के लिए जिम्मेदार जीन के प्रमोटर की क्लोनि?…

Discussion

तथ्य यह है कि बैक्टीरियल समुदायों विशिष्ट माइक्रोबियल 33,34 समुदायों के जीन जटिलता सबूत सेट व्यक्त कोशिकाओं के उप – जनसंख्या दिखा है. यह प्रोटोकॉल है कि ब्याज की किसी भी जीन की अभिव्यक्ति माइक्रोबिय?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम युवा अन्वेषक रिसर्च प्रोग्राम द्वारा वित्त पोषित है, वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय से संक्रामक रोग अनुसंधान के लिए केंद्र (ZINF) से. जुआन सी गार्सिया – Betancur के है वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय के जीवन विज्ञान के स्नातक स्कूल (GSLS) से पीएचडी साथी है.

Materials

Technique Name of the reagent Company Catalog number
MSgg composition potassium phosphate 5mM Roth 6878
MOPS 100mM Sigma-Aldrich M1254
Magnesium chloride 2mM Roth 2189.1
Calcium chloride 700μM Roth A119.1
Ferric chloride 50μM Sigma-Aldrich 157740
Zinc chloride 1μM Applichem A2076
Thiamine 2μM Sigma-Aldrich 74625
Glycerol 0.5% Roth 7533
Glutamate 0.5% Sigma-Aldrich 49621
Tryptophan 50μg/ml Sigma-Aldrich T0254
Phenylalanine 50μg/ml Sigma-Aldrich P2126
Cell fixation Paraformaldehyde Roth 0335
Name of the equipment Company Catalog number
Sonication Cell Sonicator Bandelin D-1000
Fluorescence Microscopy Fluorescence Microscope Leica DMI6000B
Name of the software Company Catalog Number
Fluorescence Microscopy AsaF Leica
Flow cytometry FCASDiva BD
Flow cytometry FlowJo Treestar
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Citazione di questo articolo
Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).
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