の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム
Summary
微生物のバイオフィルムは、一般的に特殊化した細胞の異なる集団によって構成されています。これらの集団の単一細胞解析では、蛍光レポーターを使用する必要があります。ここでは、いくつかのsubpopulationswithinを視覚化し、監視するためのプロトコルについて説明します。<em> B.枯草菌</em>蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いたバイオフィルム。
Abstract
バイオフィルム形成は、ほぼすべての細菌1-6一般的な属性です。細菌がバイオフィルムを形成するとき、細胞は主に7月10日 、他の要因の中で、タンパク質やexopolysaccharidesによって構成されている細胞外マトリックスに収められています。微生物群集は、多くの場合、11月17日特殊化した細胞の異なる集団の分化を示しています。バイオフィルム内に納められた。これらの集団が共存し、しばしばフィルム18から21の中で空間的および時間的な組織を示しています。
モデル生物の枯草菌のバイオフィルム形成は、特殊な細胞の異なる集団の分化をする必要があります。その中で、バイオフィルムの細胞外マトリックスを生成し、分泌する責任マトリックスプロデューサーの集団は、バイオフィルム形成11,19のために不可欠である。したがって、マトリックスの生産の分化は、Bのバイオフィルム形成の特徴である枯草菌。
我々は、Bのバイオフィルムのマトリックスの生産者の集団を視覚化し、定量化するために蛍光レポーターを使用している枯草菌 15,19,22-24。具体的には、マトリックスの生産者集団は、セルフ·プロデュース細胞外シグナルサーファ25の存在に応答して区別することを観察した。興味深いことに、サーファクチンは、マトリックスの生産者15の集団とは異なる特殊な細胞の集団によって生成されます。
我々は、このレポートで枯草菌のバイオフィルム内のマトリックスの生産者とサーファクチン生産者の集団を可視化し、定量化するために必要な技術的アプローチを紹介しています。これを行うには、行列の生産とサーファクチン生産に必要な遺伝子の蛍光レポーターは、Bの染色体に挿入され枯草菌 。記者は、特殊化した細胞の集団で表現されます。その後、集団は、することができます（図1参照）蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて監視されます。
特殊化した細胞の異なった集団は、細菌の多地域内で共存するという事実は私達に原核生物における遺伝子発現の調節に関する異なる視点を提供します。このプロトコルは、実験的にこの現象に対処し、それが容易に微生物のコミュニティ内で表現型の不均一性の根底にある分子機構を解明するために、他の作業モデルに適合させることができます。
Protocol
1。ラベリングB.枯草菌とバイオフィルム形成アッセイ PCRにより目的の遺伝子のプロモーター領域を増幅する。ここでは、例としてP タパ 、TASAマトリックスタンパク質26の産生に関与する遺伝子のプロモーターのクローニングを示しています。 pkm008ベクターへのクローンP タパ （Rudnerラボ、ハーバード·メディカル·スクール、ボストン、?…
Discussion
細菌群集は、特定の遺伝子の証拠一連の微生物群集33,34の複雑性を発現する細胞の集団を示しているという事実。このプロトコルは、関心のある任意の遺伝子の発現が微生物群集内に特殊化した細胞の特定の集団に限定されているかどうかを判断するのに役立ちます。伝統的な方法は、全体の微生物群集と微生物群集内で遺伝子発現の変動に遺伝子発現やマイクロアレイ解析率遺…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ヴュルツブルク大学の感染症研究センター（ZINF）から、若手研究プログラムによって運営されている。フアン·C·ガルシア·Betancurは、ヴュルツブルク大学の生命科学研究科（脂質）から博士課程の仲間です。
Materials
| Technique | Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MSgg composition | potassium phosphate 5mM | Roth | 6878 |
| MOPS 100mM | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Magnesium chloride 2mM | Roth | 2189.1 | |
| Calcium chloride 700μM | Roth | A119.1 | |
| Ferric chloride 50μM | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Zinc chloride 1μM | Applichem | A2076 | |
| Thiamine 2μM | Sigma-Aldrich | 74625 | |
| Glycerol 0.5% | Roth | 7533 | |
| Glutamate 0.5% | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| Tryptophan 50μg/ml | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| Phenylalanine 50μg/ml | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Cell fixation | Paraformaldehyde | Roth | 0335 |
| Name of the equipment | Company | Catalog number | |
| Sonication | Cell Sonicator | Bandelin | D-1000 |
| Fluorescence Microscopy | Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000B |
| Name of the software | Company | Catalog Number | |
| Fluorescence Microscopy | AsaF | Leica | |
| Flow cytometry | FCASDiva | BD | |
| Flow cytometry | FlowJo | Treestar |
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Citazione di questo articolo
Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).