Single-celle Analyse av Bacillus subtilis Biofilm Bruke fluorescensmikroskopi og flowcytometrisystemer

Summary

Mikrobielle biofilmer er generelt konstituert av distinkte subpopulasjoner av spesialiserte celler. Single-celle analyse av disse subpopulasjoner krever bruk av fluorescerende reportere. Her beskriver vi en protokoll for å visualisere og overvåke flere subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilmer med fluorescens mikroskopi og flowcytometri.

Abstract

Biofilmdannelse er en generell egenskap til nesten alle bakterier ^1-6. Når bakterier danner biofilm, celler er omsluttet av ekstracellulær matrix som er mest konstituert av proteiner og exopolysaccharides, blant andre faktorer ^7-10. Den mikrobielle samfunn innkapslet i biofilm ofte viser differensiering av distinkte subpopulasjon spesialiserte celler ^11-17. Disse subpopulasjoner sameksistere og viser ofte romlig og tidsmessig organisasjon innen biofilm ^18-21.

Biofilmdannelse i modell organisme Bacillus subtilis krever differensiering av distinkte subpopulasjoner av spesialiserte celler. Blant dem er en undergruppe av matrix produsenter, ansvarlige for å produsere og skille ut det ekstracellulære matrise av biofilm avgjørende for biofilmdannelse ^11,19. Derfor er differensiering av matrix produsenter et kjennetegn på biofilmdannelse i B. subtilis.

Vi har brukt fluoriserende journalister til å visualisere og kvantifisere subpopulasjon matrix produsenter i biofilm av B. subtilis ^15,19,22-24. Konkret har vi observert at en undergruppe av matrix produsenter skiller i respons til tilstedeværelsen av egentilvirket ekstracellulært signal surfactin ^25. Interessant, er surfactin produsert av en undergruppe av spesialiserte celler forskjellig fra en undergruppe av matrix produsentene ^15.

Vi har beskrevet i denne rapporten teknisk tilnærming er nødvendig for å visualisere og kvantifisere subpopulasjon matrix produsenter og surfactin produsenter innen biofilm av B. subtilis. For å gjøre dette, er fluorescerende reportere av gener som kreves for matrise produksjon og surfactin produksjonen satt inn i kromosomet av B. subtilis. Journalister er uttrykt bare i en undergruppe av spesialiserte celler. Deretter kan de delpopulasjoner væreovervåkes ved hjelp av fluorescens mikroskopi og flowcytometri (se fig 1).

Det faktum at ulike subpopulasjoner av spesialiserte celler eksistere innenfor flercellede samfunn av bakterier gir oss et annet perspektiv om regulering av genuttrykk i prokaryoter. Denne protokollen tar for seg dette fenomenet eksperimentelt og det kan enkelt tilpasses enhver annen fungerende modell, for å belyse de molekylære mekanismene bak fenotypiske heterogenitet innen en mikrobiell fellesskap.

Protocol

1. Merking B. subtilis og biofilmdannelse Analyseverdier Forsterke ved PCR arrangøren regionen av genet av interesse. Vi viser som eksempel kloning av P tapas, arrangøren av gener ansvarlig for produksjonen av TasA matrix protein 26. Clone P Tapa inn pkm008 vektor (skapt av Rudner lab,, USA Harvard Medical School. Boston) (fig 2). Linearize plasmidene ved enzymatisk fordøyelse (Enzyme anbefales, XhoI). Indusere naturlig kompeta…

Discussion

Det faktum at bakterielle samfunn viser subpopulasjoner av celler uttrykker spesifikke sett av gener bevis kompleksitet mikrobielle samfunn ^33,34. Denne protokollen skal bidra til å avgjøre om uttrykket av noen genet av interesse er begrenset til en bestemt undergruppe av spesialiserte celler i løpet av det mikrobielle samfunn. Visualisering av disse subpopulasjoner krever utvikling av nye teknikker, fordi tradisjonelle metoder for å overvåke genuttrykket eller microarray analyse rente nivåene av genutt…

Materials

Technique	Name of the reagent	Company	Catalog number
MSgg composition	potassium phosphate 5mM	Roth	6878
	MOPS 100mM	Sigma-Aldrich	M1254
	Magnesium chloride 2mM	Roth	2189.1
	Calcium chloride 700μM	Roth	A119.1
	Ferric chloride 50μM	Sigma-Aldrich	157740
	Zinc chloride 1μM	Applichem	A2076
	Thiamine 2μM	Sigma-Aldrich	74625
	Glycerol 0.5%	Roth	7533
	Glutamate 0.5%	Sigma-Aldrich	49621
	Tryptophan 50μg/ml	Sigma-Aldrich	T0254
	Phenylalanine 50μg/ml	Sigma-Aldrich	P2126
Cell fixation	Paraformaldehyde	Roth	0335
	Name of the equipment	Company	Catalog number
Sonication	Cell Sonicator	Bandelin	D-1000
Fluorescence Microscopy	Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000B
	Name of the software	Company	Catalog Number
Fluorescence Microscopy	AsaF	Leica
Flow cytometry	FCASDiva	BD
Flow cytometry	FlowJo	Treestar