Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

Summary

Biopelículas microbianas están constituidas generalmente por distintas subpoblaciones de células especializadas. Sola célula de análisis de estas subpoblaciones requiere el uso de reporteros fluorescentes. A continuación se describe un protocolo para visualizar y controlar varias subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biopelículas utilizando microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.

Abstract

La formación de biopelículas es un atributo general a casi todas las bacterias ^1-6. Cuando las bacterias forman biopelículas, las células están encerradas en una matriz extracelular que está mayoritariamente constituida por las proteínas y exopolisacáridos, entre otros ^7-10. La comunidad microbiana encerrado dentro de la biopelícula a menudo muestra la diferenciación de las distintas subpoblaciones de células especializadas ^11-17. Estas subpoblaciones coexisten y se muestran a menudo la organización espacial y temporal dentro del biofilm ^18-21.

La formación de biopelículas en los Bacillus subtilis organismo modelo requiere la diferenciación de las distintas subpoblaciones de células especializadas. Entre ellos, la subpoblación de los productores de matriz, responsables de producir y secretar la matriz extracelular de la biopelícula es esencial para la formación de biopelículas ^11,19. Por lo tanto, la diferenciación de los productores de la matriz es una característica de la formación de biopelículas en la B. subtilis.

Hemos utilizado los reporteros fluorescentes para visualizar y cuantificar la subpoblación de los productores de la matriz en las biopelículas de B. subtilis ^15,19,22-24. Concretamente, hemos observado que la subpoblación de los productores de matriz diferencia en respuesta a la presencia de auto-producido señal extracelular surfactina ^25. Curiosamente, surfactina es producida por una subpoblación de células especializadas diferentes de la subpoblación de los productores de matriz ^15.

Hemos expuesto en este informe, el enfoque técnico necesario para visualizar y cuantificar la subpoblación de los productores de la matriz y los productores de surfactina en las biopelículas de B. subtilis. Para hacer esto, los reporteros fluorescentes de los genes necesarios para la producción de matriz y la producción de surfactina se insertan en el cromosoma de B. subtilis. Los reporteros se expresan únicamente en una subpoblación de células especializadas. Entonces, las subpoblaciones puede sercontrolará mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo (ver Fig. 1).

El hecho de que diferentes subpoblaciones de células especializadas coexisten dentro de las comunidades de bacterias multicelulares nos da una perspectiva diferente sobre la regulación de la expresión génica en procariotas. Este protocolo trata este fenómeno de manera experimental y puede ser fácilmente adaptado a cualquier modelo de otros tratamientos, para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la heterogeneidad fenotípica dentro de una comunidad microbiana.

Protocol

1. Etiquetado de B. subtilis y ensayo de formación de biopelículas Amplificar por PCR la región promotora del gen de interés. Se muestra como ejemplo la clonación de P tapa, el promotor de los genes responsables de la producción de TASA proteína de la matriz 26. Clon P tapa en pkm008 vector (creado por el laboratorio Rudner, Escuela Médica de Harvard. Boston, EE.UU.) (Fig. 2). Alineado de los plásmidos mediante digestión enzimáti…

Discussion

El hecho de que las comunidades bacterianas muestran las subpoblaciones de células que expresan el conjunto específico de genes evidencia la complejidad de las comunidades microbianas ^33,34. Este protocolo debe ayudar a determinar si la expresión de cualquier gen de interés se limita a una subpoblación particular de células especializadas dentro de la comunidad microbiana. La visualización de estas subpoblaciones requiere el desarrollo de nuevas técnicas, porque los métodos tradicionales para control…

Materials

Technique	Name of the reagent	Company	Catalog number
MSgg composition	potassium phosphate 5mM	Roth	6878
	MOPS 100mM	Sigma-Aldrich	M1254
	Magnesium chloride 2mM	Roth	2189.1
	Calcium chloride 700μM	Roth	A119.1
	Ferric chloride 50μM	Sigma-Aldrich	157740
	Zinc chloride 1μM	Applichem	A2076
	Thiamine 2μM	Sigma-Aldrich	74625
	Glycerol 0.5%	Roth	7533
	Glutamate 0.5%	Sigma-Aldrich	49621
	Tryptophan 50μg/ml	Sigma-Aldrich	T0254
	Phenylalanine 50μg/ml	Sigma-Aldrich	P2126
Cell fixation	Paraformaldehyde	Roth	0335
	Name of the equipment	Company	Catalog number
Sonication	Cell Sonicator	Bandelin	D-1000
Fluorescence Microscopy	Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000B
	Name of the software	Company	Catalog Number
Fluorescence Microscopy	AsaF	Leica
Flow cytometry	FCASDiva	BD
Flow cytometry	FlowJo	Treestar