Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Summary

Mikrobiella biofilmer i allmänhet utgörs av distinkta subpopulationer av specialiserade celler. Enkel-cell-analys av dessa underpopulationer kräver användning av fluorescerande reportrar. Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera och övervaka flera subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilmer med fluorescens-mikroskopi och flödescytometri.

Abstract

Biofilm formation är en allmän egenskap att nästan alla bakterier ^1-6. När bakterier bilda biofilmen, celler är inneslutna i extracellulär matrix som i huvudsak utgöres av proteiner och exopolysackarider, bland andra faktorer ^7-10. Den mikrobiella innesluten i biofilmen ofta visar differentiering av distinkta subpopulation av specialiserade celler ^11-17. Dessa subpopulationer samexistera och ofta visar rumsliga och tidsmässiga organisation inom biofilmen ^18-21.

Biofilm bildning i Bacillus modellorganism subtilis kräver differentiering av olika subpopulationer av specialiserade celler. Bland dessa är den subpopulation av matrix tillverkare, som är ansvariga för att producera och utsöndra den extracellulära matrisen av biofilmen väsentlig för bildning av biofilm ^11,19. Därför är differentiering av matris producenter ett kännetecken för biofilm bildning i B. subtilis.

Vi har använt fluorescerande reportrar att visualisera och kvantifiera subpopulationen av matrisen producenter i biofilmer av B. subtilis ^15,19,22-24. Konkret har vi observerat att subpopulationen av matrisen producenter skiljer svar på närvaron av egenproducerade extracellulär signal surfaktin ^25. Intressant nog är surfaktin som produceras av en subpopulation av specialiserade celler som skiljer sig från den subpopulation av matrix tillverkare ^15.

Vi har i denna rapport den tekniska lösning som krävs för att visualisera och kvantifiera subpopulationen av matrisen producenter och producenter surfaktin inom biofilmen av B. subtilis. För att göra detta är fluorescerande reportrar av gener som krävs för matrix produktion och surfaktin produktionen in i kromosomen av B. subtilis. Reportrar uttrycks endast i en subpopulation av specialiserade celler. Därefter kan de vara subpopulationerövervakades med användning av fluorescens-mikroskopi och flödescytometri (se fig. 1).

Det faktum att olika subpopulationer av specialiserade celler samexisterar inom flercelliga grupper av bakterier ger oss ett annat perspektiv om regleringen av genuttryck i prokaryoter. Detta protokoll behandlar detta fenomen experimentellt och kan enkelt anpassas till en annan arbetsmodell, för att belysa de molekylära mekanismerna bakom fenotypisk heterogenitet inom en mikrobiell gemenskap.

Protocol

1. Märkning B. subtilis och biofilmbildning Assay Amplifiera genom PCR-promotorregionen hos genen av intresse. Vi visar som exempel kloning av P tapa, promotorn av generna som är ansvariga för produktion av Tasa matrixprotein 26. Klon P tapa i pkm008 vektor (som skapats av Rudner labbet, Harvard Medical School. Boston, USA) (Fig. 2). Linjärisera plasmiderna genom enzymatisk digerering (Enzyme rekommenderade, Xhol). Inducerar n…

Discussion

Det faktum att bakteriella samhällen visar subpopulationer av celler som uttrycker viss uppsättning av gener bevis komplexiteten i mikrobiella samhällen ^33,34. Detta protokoll bör hjälpa till att bestämma huruvida expressionen av varje gen av intresse är begränsad till en särskild underpopulation av specialiserade celler inom den mikrobiella. Visualisering av dessa subpopulationer kräver utveckling av nya tekniker, eftersom traditionella metoder för att övervaka genuttryck eller microarray analys …

Materials

Technique	Name of the reagent	Company	Catalog number
MSgg composition	potassium phosphate 5mM	Roth	6878
	MOPS 100mM	Sigma-Aldrich	M1254
	Magnesium chloride 2mM	Roth	2189.1
	Calcium chloride 700μM	Roth	A119.1
	Ferric chloride 50μM	Sigma-Aldrich	157740
	Zinc chloride 1μM	Applichem	A2076
	Thiamine 2μM	Sigma-Aldrich	74625
	Glycerol 0.5%	Roth	7533
	Glutamate 0.5%	Sigma-Aldrich	49621
	Tryptophan 50μg/ml	Sigma-Aldrich	T0254
	Phenylalanine 50μg/ml	Sigma-Aldrich	P2126
Cell fixation	Paraformaldehyde	Roth	0335
	Name of the equipment	Company	Catalog number
Sonication	Cell Sonicator	Bandelin	D-1000
Fluorescence Microscopy	Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000B
	Name of the software	Company	Catalog Number
Fluorescence Microscopy	AsaF	Leica
Flow cytometry	FCASDiva	BD
Flow cytometry	FlowJo	Treestar