واحدة من خلية قياس إفراز الدوبامين في وقت واحد مع المشبك الجهد وAmperometry
Summary
تقنية amperometric يقيس الإفراج الدوبامين من خلية واحدة عن طريق الكشف عن الأكسدة الحالية التي تنتجها أكسدة الدوبامين عفوية. في وقت واحد المشبك الجهد ومنهجية amperometry الكشف عن العلاقة بين الآلية "النشاط" الشاملة لنقل الدوبامين والدور التنظيمي لهذا النشاط على النقل العكسي للدوبامين.
Abstract
بعد صدوره في الدوبامين، المشقوق متشابك تمارس خصائصه البيولوجية عن طريق أهدافه قبل وبعد المشبكي-1. يتم إنهاء إشارة الدوبامين عن طريق الانتشار 2-3، الإنزيمات خارج الخلية 4، ونقل الغشاء 5. ونقل الدوبامين، وتقع في الشق شبه متشابك من الخلايا العصبية الدوبامين مسح صدر الأمينات من خلال تدفق الدوبامين الداخل (امتصاص). يمكن للنقل الدوبامين أيضا العمل في الاتجاه المعاكس للافراج عن الأمينات من الداخل الى الخارج في عملية تسمى النقل إلى الخارج أو هروب رأس المال من الدوبامين 5. أكثر من 20 عاما وذكرت سولزر آخرون على نقل الدوبامين يمكن أن تعمل في وضعين من النشاط: إلى الأمام (امتصاص) والعكس (هروب رأس المال) 5. يمكن للناقل عصبي صدر عن طريق هروب رأس المال من خلال نقل نقل كمية كبيرة من الدوبامين إلى الفضاء خارج الخلية، ولقد ثبت أن تلعب دورا رئيسيا في تنظيم الدوبامين خارج الخلية حomeostasis 6. نحن هنا تصف كيف يمكن استخدام المشبك التصحيح في وقت واحد وتسجيل amperometry لقياس الدوبامين صدر عبر آلية هروب رأس المال للقرار ميلي ثانية واحدة عندما الوقت يتم التحكم إمكانية الغشاء. لهذا، يتم قياس كامل الخلية الحالية والأكسدة (amperometric) إشارات في وقت واحد باستخدام مكبر للصوت Axopatch 200B (الأجهزة الجزيئية، مع مجموعة قليلة مرشح تمرير بسل في 1،000 هرتز لخلية كاملة تسجيل الحالي). لتوصيل amperometry تسجيل القطب الكهربائي لألياف الكربون مكبر للصوت الثاني (Axopatch 200B) ويتم وضعها بالقرب من غشاء البلازما والذي عقد في +700 بالسيارات. يمكن تسجيل خلية كاملة والأكسدة (amperometric) التيارات ويمكن أن تتولد العلاقة الحالية ذات الجهد باستخدام بروتوكول خطوة الجهد. على عكس المعتاد المعايرة وamperometric، الأمر الذي يتطلب التحول إلى التركيز، وتفيد التقارير الحالية مباشرة دون النظر في 7 حجم فعالة. وهكذا، فإن البيانات الناتجةتمثل الحد الأدنى لهروب رأس المال الدوبامين بسبب فقدان بعض الارسال في حل الجزء الأكبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
في وقت واحد والجهد المشبك amperometry والفوائد التالية. جميع أنواع الخلايا يمكن الوصول إليها، ويمكن استخدامها للتسجيل. تحديد الخلايا العصبية أو حيث تتم التسجيلات هو بسيط ومباشر. على وجه الخصوص، إذا تم fluorescently المسمى الخلية عن طريق إضافة علامة الفلورية للبروتين من الفائدة…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور Sanika شيروا لمراجعة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (DA026947، DA021471، وNS071122).
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
Riferimenti
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
