Real-time overvåkning av Ligand-reseptor interaksjoner med Fluorescence Resonance Energy Transfer
Summary
Vi demonstrerer FRET mellom konjugert polymer polydiacetylene (PDA) og fluoroforen festet til overflaten av PDA liposomer for sensing av biomolekyler. PDA liposomer også inneholdt reseptormolekyler på sine overflater for biomolekyler som skal brukes som prober. Ligand-reseptor interaksjoner føre til endringer i den FRET effektivitet mellom fluoroforen og PDA som er grunnlaget for sensing mekanismen.
Abstract
FRET er en prosess der energi er ikke-radiatively overført fra en begeistret donor molekyl til et første stat akseptor molekyl gjennom langtrekkende dipol-dipol interaksjoner 1. I foreliggende sensing analysen benytter vi en interessant egenskap av PDA: blå-skift i UV-Vis elektronisk absorbsjonsspektrum av PDA (figur 1) etter en analytt reagerer med reseptorer knyttet til PDA 2,3,4,7. Dette skiftet i PDA absorpsjonsspektrum gir endringer i de spektral overlapping (J) mellom PDA (akseptor) og rhodamin (donor) som fører til endringer i FRET effektivitet. Dermed blir interaksjonen mellom analytt (ligand) og reseptorer detektert gjennom FRET mellom donor fluoroforer og PDA. Spesielt, viser vi sensing av en modell proteinmolekyl streptavidin. Vi også demonstrere kovalent-binding av bovint serumalbumin (BSA) til liposomet overflaten med FRET mekanisme. Disse interaksjonene mellom tHan dobbeltlag liposomer og protein molekyler kan sanses i sanntid. Den foreslåtte fremgangsmåte er en generell metode for avføling liten kjemisk og store biokjemiske molekyler. Siden fluorescens er egentlig mer sensitiv enn kolorimetri, kan deteksjonsgrensen til analysen være i sub-nanomolar området eller lavere 8. Videre kan PDA fungere som en universell akseptor i FRET, noe som betyr at flere sensorer kan utvikles med PDA (akseptor) funksjonalisert med givere og ulike reseptorer festet på overflaten av PDA liposomer.
Protocol
Discussion
Vi har utført selektiv binding av lysin rester av protein på liposome overflaten med NHS-amin reaksjon. Dette FRET basert metode er i stand til å gjøre Sanntidsovervåkning av biotin-streptavidin binding og protein (BSA) binding til liposomet overflaten. Lignende fremgangsmåte kan brukes til å studere bindingen dynamikken ulike protein interaksjoner med deres selektive reseptorer. Det er fleksibilitet i å velge fluoroforer som vil gi endringer i J verdiene avhengig de spektrale egenskapene til fluorofore…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Økonomisk støtte til dette arbeidet ble gitt gjennom National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) og Orda på SIUC. Vi takker NSF om stipend (CHE-0959568) for kjøp av en FE-SEM. Vi vil gjerne takke professor Matthew McCarroll for personer diskusjoner. Julia Reyes vil gjerne takke COLCIENCIAS, colombianske Agency og Universidad Pedagogica y tecnologica de Colombia for henne stipend og økonomisk støtte.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
Riferimenti
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C., New, R. R. C. . Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
