Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente
Summary
Demostramos FRET entre polidiacetileno conjugado polímero (PDA) y el fluoróforo unido a la superficie de liposomas de PDA para la detección de biomoléculas. Liposomas PDA también contenía moléculas receptoras en sus superficies para las biomoléculas para ser utilizados como sondas. Ligando-receptor interacciones conducen a cambios en la eficiencia de FRET entre el fluoróforo y el PDA que es la base del mecanismo de detección.
Abstract
FRET es un proceso por el cual la energía es no radiativamente transferido de una molécula donadora excitada a una molécula aceptora del estado fundamental de largo alcance a través de interacciones dipolo-dipolo 1. En el presente ensayo de detección, que utilizan una propiedad interesante de PDA: azul-cambio en el espectro de absorción UV-Vis electrónico de PDA (Figura 1) después de un analito interacciona con los receptores unidos a PDA 2,3,4,7. Este cambio en el espectro de absorción PDA proporciona cambios en el solapamiento espectral (J) entre PDA (aceptor) y rodamina (donante) que conduce a cambios en la eficiencia de FRET. Por lo tanto, las interacciones entre analito (ligando) y los receptores se detectan a través de FRET entre los fluoróforos donantes y PDA. En particular, se muestra la detección de una molécula de proteína estreptavidina modelo. También demuestran la unión covalente de albúmina de suero bovino (BSA) a la superficie del liposoma con FRET mecanismo. Estas interacciones entre tél liposomas bicapa y moléculas de proteína se puede detectar en tiempo real. El método propuesto es un método general para la detección de productos químicos pequeño y grandes moléculas bioquímicas. Dado que la fluorescencia es intrínsecamente más sensible que la colorimetría, el límite de detección del ensayo puede ser en sub-rango nanomolar o inferior 8. Además, PDA puede actuar como un aceptor universal en FRET, lo que significa que varios sensores puede ser desarrollado con PDA (aceptor) funcionalizado con los donantes y los receptores de diferentes unidos en la superficie de los liposomas PDA.
Protocol
Discussion
Hemos llevado a cabo la unión selectiva de residuos de lisina de la proteína en la superficie de los liposomas utilizando NHS-amina reacción. Este método basado en FRET es capaz de hacer monitoreo en tiempo real de la biotina-estreptavidina y vinculante proteína (BSA) que se une a la superficie del liposoma. Procedimiento similar se puede aplicar para estudiar la dinámica de unión de interacciones de proteínas diferentes con sus receptores selectivos. Hay flexibilidad en la elección de fluoróforos que proporci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), el Centro de Tecnología de Materiales (MTC) y la ORDA en SIUC. Damos las gracias a una subvención NSF (CHE-0959568) para la compra de un FE-SEM. Nos gustaría dar las gracias al profesor Mateo McCarroll útil para los debates. Julia Reyes agradecer a COLCIENCIAS, Agencia Colombiana y la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia por su erudición y apoyo financiero.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
Riferimenti
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