Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Sommario

Forward genetica è un metodo efficace per svelare il livello molecolare di come Toxoplasma Egresses dalla sua cellula ospite. I protocolli sono fornite mutagenizzare chimicamente parassiti, per arricchire mutanti con difetti in uscita indotta, e convalidare il fenotipo di mutanti clonati.

Abstract

La diffusa, intracellulare obbligato, protozoo parassita Toxoplasma gondii causa malattia opportunistica in pazienti immuno-compromessi e causa difetti di nascita al momento dell'infezione congenita. Il ciclo di replica litico è caratterizzato da tre fasi: 1. invasione attiva di una cellula ospite nucleata; 2. la replicazione all'interno della cellula ospite; 3. uscita attiva dalla cellula ospite. Il meccanismo di uscita è sempre più apprezzato come un processo unico e altamente regolamentato, che è ancora poco conosciuta a livello molecolare. I percorsi di segnalazione sottostanti uscita sono stati caratterizzati mediante l'uso di agenti farmacologici che agiscono su diversi aspetti dei percorsi ^1-5. Come tali, diversi inneschi indipendenti di uscita sono stati identificati quali convergono tutti rilascio intracellulare di Ca ^{2 +,} un segnale che è anche critica per l'invasione della cellula ospite ^6-8. Questa intuizione ha informato di un approccio del gene candidato che ha portato alla identizione degli impianti come il calcio proteina chinasi dipendente (CDPK) coinvolti in uscita ^9. Inoltre, molti recenti scoperte in uscita comprensione sono state realizzate con (chimica) approcci genetici ^10-12. Per combinare la ricchezza di informazioni farmacologica con l'accessibilità crescente genetica di Toxoplasma abbiamo recentemente istituito una schermata che permette l'arricchimento per i mutanti parassita con un difetto della cellula ospite in uscita ^13. Anche se mutagenesi chimica utilizzando N-etil-N-nitrosourea (ENU) o etile metanosolfonato (EMS) è stata utilizzata per decenni nello studio della biologia Toxoplasma ^11,14,15, solo recentemente ha la mappatura genetica delle mutazioni alla base dei fenotipi diventano routine ^{16 -18.} Inoltre, generando termosensibili mutanti, processi essenziali possono essere sezionati e le sottostanti direttamente geni identificati. Questi mutanti comportano come tipo selvatico sotto la temperatura permissiva (35 ° C), ma non proliferate alla temperatura restrittivo (40 ° C) come risultato della mutazione in questione. Qui illustrano un nuovo metodo di screening per isolare mutanti fenotipica con un sensibile alla temperatura fenotipo uscita ^13. La sfida per schermi egress è quello di separare egressed da non egressed parassiti, che è complicata dal rapido re-invasione e l'adesività generale dei parassiti per le cellule ospiti. Una schermata di uscita precedentemente stabilito si basava su una serie complessa di passaggi biotinilazione per separare intracellulare dai parassiti extracellulari ^11. Questo metodo inoltre non generare mutanti condizionali conseguente fenotipi deboli. Il metodo qui descritto supera il forte attaccamento di egressing parassiti includendo un concorrente glicano, solfato di destrano (DS), che impedisce parassiti di attaccarsi alla cellula ospite ^19. Inoltre, i parassiti extracellulari sono specificamente ucciso da pirrolidina ditiocarbammato (PDTC), che lascia i parassiti intracellulariilleso ^20. Pertanto, con una nuova schermata fenotipica per isolare specificamente parassiti mutanti con difetti in uscita indotta, il potere della genetica possono ora essere pienamente dispiegato per svelare i meccanismi molecolari alla base della cellula ospite uscita.

Protocollo

Panoramica

I protocolli sono forniti per definire la prima dose di mutageno portando ad una uccisione 70% dei parassiti (protocollo 1). La procedura successiva è prevista per arricchire i mutanti egress indotte da un pool mutagenizzato parassita (protocollo 2, Figura 2). Questo è seguito da un protocollo per testare l'incidenza di mutanti egress in piscina arricchito, o per convalidare il fenotipo uscita in mutanti individuali (protocollo 3). Infine, viene fornito un protocollo per generare cloni singolo parassita da popolazioni arricchiti mediante diluizione limitante (protocollo 4).

1. Titolazione del mutagen....

Discussione

Il protocollo descritto fornisce un metodo efficiente per isolare mutanti Toxoplasma con un difetto di uscita. Abbiamo isolato con successo mutanti lungo varie fasi del percorso di uscita, alcuni dei quali hanno un fenotipo duplice invasione ^13. Eventuali effetti sulla invasione può essere determinata utilizzando la cosiddetta rosso-verde saggio, che differenzia invasa da non-invasi da parassiti colorazione differenziale anticorpi ^23,24. Per entrambi i saggi invasione e di uscita pot.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 Stock M in DMSO, conservare a -20 ° C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 Stock M in DMSO, conservare a -20 ° C
Destrano solfato	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 Stock mM in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Portafiltro	Cole-Parmer	540100
3 um policarbonato filtro	WhatmanSchleicher & Schuell	110612
Emocitometro	Hausser Scientific	1475
CO 2 incubatori	Diversi produttori		Umidificato, 5% CO 2, a 35, 37 e 40 ° C
Microscopio a fluorescenza	Diversi produttori		Idealmente invertito, a grande campo con l'obiettivo di petrolio 63x o 100x

HBSSc (secondo Black et al ^11.):

• 98,0 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (numero di catalogo Hyclone SH30588)
• 100 MgCl ul 1M ₂ (100 mM end)
• 100 pl 1M CaCl ₂ (100 mM end)
• 2,0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO ₃ (10 mM end)