מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

Summary

קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של כמה<em> Toxoplasma</em> Egresses מהתא המארח שלה. הפרוטוקולים ניתנים כימית mutagenize טפילים, להעשיר את מוטנטים עם פגמים יציאה יזומה, ולאמת את הפנוטיפ של מוטציות משובטים.

Abstract

נפוצה, מחייבים תאיים, protozoan הטפיל Toxoplasma gondii גורם למחלות אופורטוניסטית ב חיסונית שנפרצו חולים וגורם למומים מולדים עם זיהום מולד. מחזור שכפול ממס מתאפיינת בשלושה שלבים: 1. הפלישה פעיל של תא פונדקאי גרעיני: 2. שכפול בתוך התא המארח, 3. יציאה פעילה מן התא המארח. מנגנון של יציאה היא יותר ויותר להיות מוערך כתהליך, ייחודי פיקוח הדוק, אשר עדיין ממעטים להבין ברמה המולקולרית. מסלולי איתות יציאה בבסיס אופיינו באמצעות סוכני פרמקולוגיים הפועלים על היבטים שונים של מסלולים ^1-5. לפיכך, גורמים עצמאיים שונים של יציאה זוהו שכל להתכנס על שחרורו של Ca ^{2 +} תאיים, סימן שהוא גם קריטי עבור הפלישה התא המארח ^6-8. תובנה זו הודיע ​​הגן המועמד הגישה שהוביל identiאחת מהבעיות הנגזרות מהחלוקה של הצמח כמו סידן קינאז החלבון תלויה (CDPK) מעורב יציאה ^9. בנוסף, פריצות הדרך האחרונות מספר יציאה הבנה נעשו באמצעות (כימי) גישות גנטיות ^10-12. לשלב שפע של מידע תרופתי עם נגישות גנטי גדל והולך של Toxoplasma לנו לאחרונה הוקמה מסך המאפשר העשרה מוטציות טפיל עם פגם יציאה התא המארח ^13. למרות mutagenesis כימי באמצעות N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) או אתיל methanesulfonate (EMS) שימש במשך עשרות שנים בחקר הביולוגיה Toxoplasma ^11,14,15, רק לאחרונה יש מיפוי גנטי של מוטציות שבבסיס פנוטיפים הופכים לשגרה ^{16 -18.} יתר על כן, על ידי יצירת מוטציות רגישות טמפרטורה, תהליכים חיוניים ניתן גזור ואת הגנים הבסיסיים מזוהה באופן ישיר. מוטציות אלה מתנהגים כמו wild-type תחת טמפרטורה מתירנית (35 ° C), אבל לא מצליחים עמ 'roliferate בטמפרטורת כובל (40 ° C) כתוצאה של מוטציה הנדון. כאן אנו להמחיש שיטה חדשה ההקרנה פנוטיפי לבודד מוטנטים עם פנוטיפ הטמפרטורה רגיש יציאה ^13. האתגר עבור מסכי היציאה היא להפריד egressed מן הלא egressed טפילים, אשר מורכבת על ידי מהיר מחדש הפלישה הדביקות הכללי של טפילים לתאי המארח. מסך יציאה הוקמה בעבר היה מבוסס על סדרה של צעדים מסורבלת biotinylation להפריד בין תאיים טפילים תאיים ^11. שיטה זו גם לא ליצור מוטנטים מותנים וכתוצאה מכך פנוטיפים חלשים. השיטה המתוארת כאן מתגבר מצורף חזקה של egressing טפילים על ידי הכללת מתחרה glycan, סולפט dextran (DS), המונע טפילים יידבקו אל התא המארח ^19. יתר על כן, טפילים תאיים נהרגים במיוחד את ידי pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), מה שמשאיר טפילים תאייםללא פגע ^20. לכן, עם מסך פנוטיפי חדש במיוחד לבודד מוטנטים טפיל עם פגמים יציאה יזומה, כוחה של הגנטיקה כעת ניתן לפרוס באופן מלא לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התא המארח יציאה.

Protocol

סקירה כללית הפרוטוקולים ניתנים 1 להגדיר את המינון של mutagen שמוביל להרג 70% הטפילים (פרוטוקול 1). ההליך הבא ניתן להעשיר את מוטנטים היציאה המושרה מתוך מאגר הטפיל mutagenized (פרוטוקול 2, איור 2). זה מלווה בפרוטוקול לבדוק את השכיחות של מוטציות הי?…

Discussion

פרוטוקול תיאר מספק שיטה יעילה לבודד מוטנטים Toxoplasma עם מום יציאה. אנחנו מבודדים בהצלחה מוטציות לאורך השלבים השונים של מסלול יציאה, שחלקם יש פנוטיפ הפלישה כפול ^13. השפעה על הפלישה ניתן לקבוע באמצעות מה שמכונה אדום ירוק assay, אשר מבדיל בין פלש ללא פלש טפילים י?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective

HBSSc (according to Black et al.¹¹):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
• 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end)
• 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end)
• 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)