分離するために遺伝学的スクリーニングトキソプラズマホストセル出口変異体

Summary

フォワード遺伝学はどのように分子レベルで解明するための強力な方法です<em>トキソプラズマ</em>その宿主細胞から出力する。プロトコルは化学的に寄生虫を突然変異を起こさせるために提供され、誘導される出口の欠陥を持つ変異体を濃縮し、クローニングした変異体の表現型を検証します。

Abstract

広く、偏性細胞内、原虫寄生虫トキソプラズマ原虫は、免疫不全患者に日和見疾患を引き起こす先天性感染症に先天性欠損症を引き起こす。 1：溶菌複製サイクルは3つの段階によって特徴づけられる。核宿主細胞の積極的な侵攻2。宿主細胞内で複製、3。宿主細胞からのアクティブな出口。出口のメカニズムは、ますますまだ不十分分子レベルで理解されている、ユニークで高度に調節されたプロセスとして、高く評価されています。出口の根底にあるシグナル伝達経路は、経路^1-5のさまざまな側面に作用する薬剤の使用によって特徴づけられている。このように、出口のいくつかの独立したトリガーはすべての細胞内Ca ^{2 +、}また、宿主細胞の浸潤^6-8重要である信号のリリースに収束するが同定されている。この洞察は、識別子につながった候補遺伝子アプローチを通知出口⁹に関与するカルシウム依存性プロテインキナーゼ（CDPK）のような植物のfication。さらに、理解の出口における最近のいくつかのブレークスルーが（化学）遺伝的アプローチを^10-12を使用して行われています。 トキソプラズマの増加遺伝アクセシビリティと薬理学の豊富な情報を結合するために我々は最近、宿主細胞の出口¹³の欠陥を持つ寄生虫変異体の濃縮を可能にする画面を設立しました。 N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）またはエチルメタンスルホネート（EMS）を使用して、化学的突然変異誘発はトキソプラズマ生物学^11,14,15の研究に何十年も使用されているが、ごく最近の基礎となる突然変異の遺伝子マッピングを持つ表現型は、ルーチン¹⁶になる^-18。さらに、温度​​感受性変異体を生成することにより、本質的なプロセスは、解剖することができ、基礎となる遺伝子が直接識別されます。これらの変異体は、許容温度（35℃）下で野生型として動作するが、pに失敗する問題の突然変異の結果として、制限温度（40℃）でroliferate。ここでは、温度に敏感な出力表現型¹³に突然変異体を単離するための新たな表現型のスクリーニング方法を示しています。出力画面の課題は、宿主細胞に寄生虫の再侵攻、高速かつ一般的な粘りによって複雑にされた非egressed寄生虫からegressed分離することである。以前に確立された出力画面は、細胞外寄生体¹¹から細胞を分離するビオチン化手順の面倒なシリーズに基づいていた。また、このメソッドは、弱い表現型の結果、条件付き変異体を生成しませんでした。ここで説明する方法は、宿主細胞¹⁹に付着する寄生虫を防ぐことが糖鎖のライバル、デキストラン硫酸（DS）を含めることによって寄生虫をegressingの強い愛着を克服しています。また、細胞外寄生体は、特に細胞内寄生体を残しピロリジンジチオカルバメート（PDTC）でオフに殺される²⁰無傷。したがって、具体的に誘発される出口の欠陥で寄生虫の変異体を単離するための新たな表現型の画面で、遺伝学の力は完全に宿主細胞の出口の根底にある分子メカニズムを解明するために展開することができます。

Protocol

概要プロトコルは、最初の寄生虫の70％の殺害（プロトコル1）につながる変異原の投与量を定義するために提供されています。次の手順は、突然変異寄生虫プール（プロトコル2、図2）から誘導される出口の変異体を豊かにするために提供されます。これは、濃縮されたプールで出口の変異体の発生率をテストするためのプロトコルが続いている、または個々の変異体（プ?…

Discussion

記述されているプロトコルは、出口の欠陥とはトキソプラズマの変異体を単離するための効率的な方法を提供する。デュアル侵略の表現^13を持っているそのうちのいくつかは我々が正常に、出力経路の様々なステップに沿って変異体を単離した。侵略の潜在的な影響は、差動抗体染色^23,24によって非侵略寄生虫から侵入区別いわゆる赤緑のアッセイを用いて決定す?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective

HBSSc (according to Black et al.¹¹):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
• 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end)
• 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end)
• 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)