Forward genetik är en kraftfull metod att riva upp molekylär nivå hur<em> Toxoplasma</em> Utträder från sin värdcell. Protokoll finns att kemiskt mutera parasiter, anrika mutanter med defekter i inducerad utträde, och validera fenotypen av klonade mutanter.
Den utbredda, obligat intracellulär, protozoparasit Toxoplasma gondii orsakar opportunistisk sjukdom hos immunkomprometterade patienter och orsakar fosterskador vid kongenital infektion. Den lytiska replikationscykeln kännetecknas av tre steg: 1. aktivt invasion av en kärnförsedda värdcell, 2. replikation inuti värdcellen, 3. aktiv utstigning ur värdcellen. Mekanismen för avstigning i allt högre grad uppskattad som en unik, starkt reglerad process, som fortfarande är dåligt förstådd på molekylär nivå. De signalvägar bakom utträde har präglats genom användning av farmakologiska substanser som påverkar olika aspekter av de vägar 1-5. Som sådan har flera oberoende utlöser utträde identifierats vilka alla konvergerar på frisättningen av intracellulära Ca 2 +, en signal som är också kritisk för värdcellen invasion 6-8. Denna insikt informerat en strategi kandidat gen som ledde till identiklassificering av växter som kalcium beroende proteinkinas (CDPK) som deltar i avstigning 9. Dessutom har flera nya genombrott i förståelsen utträde gjorts med (kemisk) genetiska metoder 10-12. Att kombinera den rikedom av farmakologiska information med den ökande genetiska tillgängligheten av Toxoplasma vi nyligen inrättat en skärm som tillåter anrikning för parasitens mutanter med en defekt i värdcell utträde 13. Även kemisk mutagenes med användning av N-etyl-N-nitrosokarbamid (ENU) eller etylmetansulfonat (EMS) har använts under årtionden för studier av Toxoplasma biologi 11,14,15, först nyligen har genetisk kartläggning av mutationer som ligger bakom de fenotyper blivit rutin 16 -18. Vidare, genom att generera temperaturkänsliga mutanter, kan väsentliga processer dissekerades och de underliggande gener direkt identifieras. Dessa mutanter uppträder som vild-typ enligt den tillåtna temperaturen (35 ° C), men misslyckas med att proliferate vid den restriktiva temperaturen (40 ° C) som en följd av mutationen i fråga. Här illustrerar vi en ny fenotypisk screening metod för att isolera mutanter med en temperaturkänslig utträde fenotyp 13. Utmaningen för utträde skärmar är att separera egressed från icke-egressed parasiter, vilket kompliceras av snabb åter-invasion och allmänt klibbighet av parasiterna till värdcellerna. En tidigare etablerade avstigning skärmen bygger på en besvärlig serie biotinyleringsbeting åtgärder för att separera intracellulär från extracellulära parasiter 11. Denna metod inte heller genererar villkorliga mutanter resulterar i svaga fenotyper. Den metod som beskrivs här övervinner starka engagemang för utträder parasiter genom att inkludera en glykan konkurrent dextransulfat (DS), som förhindrar parasiter fastnar värdcellen 19. Dessutom är extracellulära parasiter specifikt avdödades genom pyrrolidin-ditiokarbamat (PDTC), vilket lämnar intracellulära parasiteroskadda 20. Därför, med en ny fenotypisk skärm för att specifikt isolera parasiter mutanter med defekter i inducerad utträde, kan kraften i genetik nu fullt ut för att reda ut de molekylära mekanismerna bakom utträde värdcell.
Den beskrivna protokollet tillhandahåller en effektiv metod för att isolera Toxoplasma mutanter med en utgång defekt. Vi har med framgång isolerat mutanter längs olika stegen av egress-vägen, av vilka några har en dubbel invasion fenotyp 13. Potentiella effekter på invasion kan bestämmas med hjälp av så kallade röd-gröna analys, som skiljer invaderade från icke-invaderat parasiter av differentiell antikroppsfärgning 23,24. För båda invasion och avstigning analyser ka…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av American Heart Association Scientist utveckling Grant 0635480N och National Institutes of Health forskningsanslag AI081220. BIC stöds av en Tempelherreorden Eye Foundation forskningsanslag.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20°C |
Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher & Schuell | 110612 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C | |
Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective |
HBSSc (according to Black et al.11):