Fluorescens-mikroskopi Screening og næste generation sekventering: Nyttige værktøjer til identifikation af gener involveret i organel Integrity
Summary
En grundlæggende søgen i cellebiologi er at definere de mekanismer, der ligger til grund for identiteten af de organeller, der gør eukaryote celler. Her har vi foreslår en metode til at identificere de gener der er ansvarlige for den morfologiske og funktionelle integritet af planteceller organeller med fluorescensmikroskopi og næste generation sekventering værktøjer.
Abstract
Denne protokol beskrives et fluorescensmikroskop-baseret screening af Arabidopsis kimplanter og beskriver hvordan man omsætter recessive mutationer, der ændrer den subcellulære fordeling af en specifik mærket fluorescerende markør i den sekretoriske reaktionsvej. Arabidopsis er en kraftig biologisk model for genetiske undersøgelser på grund af dets genom størrelse, generationstid, og bevarelse af molekylære mekanismer blandt kongeriger. Matrixen genotype som en fremgangsmåde til at kortlægge mutation i alternativ til den traditionelle metode er baseret på molekylære markører er fordelagtig, fordi det er relativt hurtigere og tillade kortlægning af adskillige mutanter i en meget kort tid. Denne fremgangsmåde tillader identifikation af proteiner, der kan påvirke integriteten af organel i planter. Her som et eksempel, foreslår vi en skærm til at mappe gener er vigtige for integriteten af det endoplasmatiske reticulum (ER). Vores fremgangsmåde kan imidlertid let udvides til andre vegetabilske celleorganeller(Se for eksempel 1,2), og repræsenterer således et vigtigt skridt mod at forstå det molekylære grundlag for andre subcellulære strukturer.
Protocol
Discussion
Her beskrives en konfokal mikroskopi-baseret screening til identifikation af endomembrane mutanter. Denne fremgangsmåde kan let udvides til andre organeller i cellen, for hvilke specifikke fluorescerende protein markører er tilgængelige. Skærmen er baseret på identifikation af mutanter, der viser en afvigende fordeling af fluorescerende markør, enten i målet organel eller organeller, der ikke formodes at indeholde markør. Henholdsvis disse mutanter repræsenterer populationer, hvor enten evne organel til subcomp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender støtte fra Chemical Sciences, Geosciences og Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (tildeling antal DE-FG02-91ER20021) og National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Vi er taknemmelige for Karen Bird til redigering af manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
Riferimenti
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetica. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetica. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
