Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.
Dit protocol beschrijft een fluorescentie microscoop op basis van screening van Arabidopsis zaailingen en beschrijft hoe in kaart te brengen recessieve mutaties die de subcellulaire distributie van een specifiek gelabeld fluorescente marker in de secretieroute te wijzigen. Arabidopsis is een krachtig biologisch model voor genetisch onderzoek vanwege de grootte van het genoom, generatietijd, en behoud van de moleculaire mechanismen onder de koninkrijken. De array genotypering als een benadering van de mutatie in kaart te brengen alternatief voor de traditionele methode op basis van moleculaire merkers is voordelig omdat het relatief sneller en kunnen aan het in kaart brengen van de verschillende mutanten in een heel kort tijdsbestek. Deze methode maakt het mogelijk de identificatie van eiwitten die de integriteit van de organellen in planten kunnen beïnvloeden. Hier, als voorbeeld, stellen we een scherm om de kaart te genen die belangrijk zijn voor de integriteit van het endoplasmatisch reticulum (ER). Onze aanpak is echter gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere planten celorganellen(Zie bijvoorbeeld 1,2), en dus een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van de moleculaire basis gelden voor andere subcellulaire structuren.
Hier beschreven een confocale microscopie-screening voor de identificatie van endomembraan mutanten. Deze benadering kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere organellen van de cel die specifieke fluorescente eiwit markers zijn. Het scherm is gebaseerd op de identificatie van mutanten die een afwijkende verdeling van de fluorescerende merker hetzij het doel organel of organellen die niet bedoeld om de marker bevatten vertonen. Respectievelijk deze mutanten vertegenwoordigen populaties die hetzij het vermogen van de o…
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen steun van de Chemische Wetenschappen, Geowetenschappen en Biosciences Division, Bureau van Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (award aantal DE-FG02-91ER20021) en de National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Wij zijn dankbaar voor mevrouw Karen Vogel voor het bewerken van het manuscript.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
NaOAc | J.T Baker | |
Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |