Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt
Summary
Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt ein Fluoreszenzmikroskop-basierte Screening von Arabidopsis-Keimlinge und beschreibt, wie rezessive Mutationen, die die subzelluläre Verteilung eines spezifischen fluoreszierenden Marker markiert in den sekretorischen Weg verändern zu kartieren. Arabidopsis ist ein leistungsfähiges biologisches Modell für genetische Studien wegen seiner Genomgröße, Generationszeit, und die Erhaltung der molekularen Mechanismen unter Königreiche. Die Array-Genotypisierung als ein Ansatz, um die Mutation in Alternative zu den traditionellen Verfahren auf der Basis molekularer Marker zugeordnet ist vorteilhaft, weil es relativ schneller ist und kann die Zuordnung von mehreren Mutanten in wirklich kurzer Zeit ermöglichen. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Proteinen, die die Integrität einer Organelle in Pflanzen beeinflussen können. Hier, als Beispiel, schlagen wir einen Bildschirm zur Karte Gene, die für die Integrität des endoplasmatischen Retikulum (ER). Unser Ansatz kann aber leicht auf andere Pflanzen Zellorganellen erweitert werden(Siehe zum Beispiel 1,2), und stellt daher einen wichtigen Schritt zum Verständnis der molekularen Grundlagen für die anderen subzellulären Strukturen.
Protocol
Discussion
Hier beschreibt eine konfokale Mikroskopie-Screening zur Identifizierung von Mutanten Endomembransystem. Dies kann leicht zu einer anderen Organellen der Zelle, für die spezifische fluoreszierende Protein-Marker zur Verfügung verlängert werden. Der Bildschirm wird auf die Identifizierung von Mutanten, die eine anomale Verteilung der fluoreszierenden Marker, entweder in der Zielorganelle oder Organellen, die nicht dazu bestimmt sind, um den Marker enthalten, die zeigen. Jeweils stellen diese Mutanten untersucht, bei d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die Unterstützung von der Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (Vergabe-Nummer DE-FG02-91ER20021) und der National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Wir sind dankbar, dass Frau Karen Vogel für die Bearbeitung des Manuskripts.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
Riferimenti
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