형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구
Summary
세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.
Abstract
이 프로토콜은 Arabidopsis 모종의 형광 현미경 기반 검사를 설명하고 분비 경로에서 특정 태그를 형광 마커의 subcellular 분포를 변경 열성 돌연변를 매핑하는 방법에 대해 설명합니다. Arabidopsis 때문에 자사의 게놈 크기의 유전자 연구를위한 강력한 생물 학적 모델이며, 생성 시간, 그리고 왕국 간의 분자 메커니즘의 보존. 분자 마커를 기반으로 전통적인 방법과 대안에 변이를 매핑하는 방식으로 genotyping 배열은 비교적 빠른 있기 때문에 유리하고 아주 짧은 기간에 여러 돌연변이의 매핑을 허용할 수 있습니다. 이 방법은 식물의 어떤 organelle의 무결성에 영향을 미칠 수있는 단백질의 식별이 가능합니다. 여기 예로, 우리는 endoplasmic reticulum (ER)의 무결성을위한 중요한지도 유전자에 대한 화면을 제안합니다. 우리의 접근법은 그러나, 쉽게 다른 식물 세포 organelles로 연장하실 수 있습니다(예를 들어 1,2 참조), 따라서 다른 subcellular 구조를 지배하는 분자 기초를 이해 향한 중요한 단계를 나타냅니다.
Protocol
Discussion
여기 endomembrane의 돌연변이의 식별을 위해 공촛점 현미경 기반 검사를 설명했다. 이 접근법은 쉽게 특정 형광 단백질 마커를 사용할 수있는 세포의 다른 organelles로 연장하실 수 있습니다. 화면이 대상 organelle이나 마커를 포함해야하지 않는 organelles로 중 형광 마커의 탈선 분포를 보여 돌연변이의 신분에 따라 달라집니다. 각각 이러한 돌연변 마커를 subcompartimentalize하기 organelle의 능력 중 하나가 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 화학 과학, Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학, 과학의 사무실, 에너지의 미국과 (보너스 번호 DE-FG02-91ER20021) 및 국립 과학 재단 (MCB 0,948,584) (FB)의 사무실에 의해 지원을 인정합니다. 우리는 원고를 편집 미스 카렌 버드에 감사합니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
Riferimenti
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