Fluorescencia microscopia de Selección y secuenciación de próxima generación: Herramientas útiles para la identificación de genes implicados en la integridad de los Orgánulos
Summary
Una misión fundamental de la biología celular es definir los mecanismos que subyacen a la identidad de los orgánulos que hacen que las células eucariotas. Aquí proponemos un método para identificar los genes responsables de la integridad morfológica y funcional de los orgánulos de las plantas mediante microscopía de fluorescencia y la próxima generación de herramientas de secuenciación.
Abstract
Este protocolo describe un microscopio de fluorescencia basada en el cribado de las plántulas de Arabidopsis y se describe cómo asignar las mutaciones recesivas que alteran la distribución subcelular de un marcador específico etiquetado fluorescente en la vía secretora. Arabidopsis es un poderoso modelo biológico para estudios genéticos debido a su tamaño del genoma, tiempo de generación y conservación de los mecanismos moleculares entre reinos. La matriz de genotipado como una aproximación al mapa de la mutación en alternativa al método tradicional, basado en marcadores moleculares, es ventajoso porque es relativamente más rápido y puede permitir la asignación de varios mutantes en un marco de tiempo muy corto. Este método permite la identificación de proteínas que pueden influir en la integridad de cualquier orgánulo en las plantas. Aquí, como un ejemplo, proponemos una pantalla para los genes del mapa importantes para la integridad del retículo endoplasmático (ER). Nuestro enfoque, sin embargo, se puede extender fácilmente a otros orgánulos de las células vegetales(Véase por ejemplo 1,2), y por lo tanto representa un paso importante hacia la comprensión de las bases moleculares que rigen en otras estructuras subcelulares.
Protocol
Discussion
Aquí se describe una confocal de microscopía basada en el cribado para la identificación de mutantes endomembrane. Este enfoque se puede extender fácilmente a otros orgánulos de la célula para que determinados marcadores de proteínas fluorescentes están disponibles. La pantalla se basa en la identificación de mutantes que muestran una distribución aberrante del marcador fluorescente o bien en el orgánulo meta o para orgánulos que no se supone que contienen el marcador. Respectivamente, estos mutantes represe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el apoyo de la Ciencias Químicas, Geociencias y Ciencias Biológicas División de la Oficina de Ciencias Básicas de Energía, Oficina de Ciencia, EE.UU. Departamento de Energía (número de adjudicación DE-FG02-91ER20021) y la National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Estamos muy agradecidos a la Sra. Karen Bird para la edición del manuscrito.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
Riferimenti
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetica. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetica. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
