Summary

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Published: April 13, 2012
doi:

Summary

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Abstract

Bu protokol Arabidopsis fidelerinin bir floresan mikroskop tabanlı tarama açıklanır ve sekretuar yolun belirli bir etiketli floresan marker Subselüler dağılımını değiştirebilir resesif mutasyonlar eşlemek anlatılmaktadır. Arabidopsis nedeniyle genom büyüklüğü genetik çalışmalar için güçlü bir biyolojik model, nesil zaman ve krallıkları arasında moleküler mekanizmaları korunması. Moleküler belirteçler dayalı geleneksel yönteme alternatif olarak mutasyon eşlemek için bir yaklaşım olarak genotipleme dizi nispeten hızlı olduğu için avantajlı olduğunu ve gerçekten çok kısa süre içerisinde birçok mutantların haritalama izin verebilir. Bu yöntem, bitkilerde herhangi bir organelidir bütünlüğünü etkileyebilir proteinlerin tanımlama sağlar. Burada bir örnek olarak, endoplazmik retikulum (ER) bütünlüğü için önemli gen haritası için bir ekran öneriyoruz. Bizim yaklaşımımız, ancak kolayca diğer bitki hücre organelleri uzatılabilir(Örneğin 1,2 bakınız), ve böylece diğer hücre içi yapıları düzenleyen moleküler temelini anlamaya yönelik önemli bir adımı temsil etmektedir.

Protocol

1. EMS Tedavi Arabidopsis thaliana tohumu T / A mutasyonlar 5-7 C / G elde genomunun C-etmek-T içinde değişikliklerin indüklemektedir mutajen madde etil metan sülfonat (EMS) 3,4 olarak kullanılarak mutagenized edilir. Organel floresan işaretleyici (özellikle, bu çalışmada ssGFPHDEL (sinyal sekansı-GFP-HDEL tetrapeptide) bir ER belirteç olarak kullanılmıştır) taşıyan 0.8 g Arabidopsis tohumları (~ 40.000 tohum) tartılır. <li…

Discussion

Burada endomembrane mutantların tanımlanması için bir konfokal mikroskopi tabanlı tarama nitelendirdi. Bu yaklaşım kolaylıkla spesifik floresan protein belirteçler mevcut olduğu hücrenin diğer organelleri kadar uzatılabilir. Ekran hedef organel veya işaretleyici içeren gerekiyordu değil organeller için ya floresan işaretleyici bir anormal dağılım gösteren mutantların tanımlanması dayanmaktadır. Sırasıyla, bu mutantlar işaretleyici subcompartimentalize için organel yeteneği ya tehlikeye dü…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Kimyasal Bilimler, Yer Bilimleri ve Biyolojik Bilimler Bölümü, Temel Enerji Bilimler, Fen Dairesi, ABD Enerji Bakanlığı (ödül sayısı DE-FG02-91ER20021) ve Ulusal Bilim Vakfı (MCB 0.948.584) (FB) Müdürlüğü tarafından destek için minnettarım. Biz yazının düzenleme için Bayan Karen Kuş minnet borçluyuz.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Ethylmethane sulfonate Sigma M0880
NaOH J.T Baker 3722-05
Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins Phyto technolog laboratorie M404
Phytagel Sigma P8169-1Kg
RNeasy mini kit Qiagen 74104
Master pure plant leaf DNA purification kit Epicentre MPP92100
Bioprime DNA labeling system Invitrogen 18094-011
Alcohol 200 proof Decan laboratories inc. 2716
NaOAc J.T Baker  
Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array Affymetrix 900385
Falcon tubes 50 mL corning 430290
Eppendorf tubes 1.5 mL    
Filter paper 90mm Whatman 1001090
Analytical Balance Mettler Toledo AB54-S n.a
Nutating (wave) shaker Heidolph polymax 1040 n.a
Centrifuge Eppendorf 5417-R n.a

Riferimenti

  1. Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
  2. Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , (2011).
  3. Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
  4. Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
  5. Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetica. 164, 731-740 (2003).
  6. Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetica. 48, 561-580 (1963).
  7. Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
  8. Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
  9. Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
  10. Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
  11. Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
  12. Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
  13. Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
  14. Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  15. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , (2002).
  16. Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
check_url/it/3809?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Stefano, G., Renna, L., Brandizzi, F. Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity. J. Vis. Exp. (62), e3809, doi:10.3791/3809 (2012).

View Video