Cholesterin Efflux-Assay
Summary
Die Cholesterin-Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen und die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu quantifizieren. Der Test besteht aus Markieren von Zellen mit Cholesterin, Äquilibrierung von Cholesterin unter den intrazellulären Pools und Freisetzung von Cholesterol an einer extrazellulären Akzeptor.
Abstract
Cholesteringehalt von Zellen innerhalb der sehr engen Grenzen gehalten werden, zu viel oder zu wenig Cholesterin in einer Zelle führt zu Störungen von Zellmembranen, Apoptose und Nekrose 1. Die Zellen können Quelle Cholesterin aus intrazellulären Synthese und von Plasma-Lipoproteine sind beide Quellen ausreichend, um Zellen vollständig erfüllen die Anforderungen für Cholesterin. Die Prozesse der Cholesterin-Synthese und die Aufnahme ist streng reguliert und Mängel an Cholesterin sind selten zwei. Übermäßige Cholesterin ist häufiger Problem 3. Mit Ausnahme von Hepatozyten und in gewissem Maße NNR-Zellen, Zellen sind nicht in der Lage, Cholesterin zu degradieren. Die Zellen haben zwei Möglichkeiten, um ihre Cholesterin-Gehalt zu reduzieren: auf Cholesterin in Cholesterylester, eine Option mit begrenzten Kapazitäten zu konvertieren, wie eine Überlastung Zellen mit Cholesterylestern ist auch giftig, und Cholesterin Efflux, eine Option, mit potenziell unbegrenzte Kapazität. Cholesterin Efflux ist ein specific Prozess, der durch eine Reihe von intrazelluläre, wie ATP-Bindungs-Cassette-Transporter-Proteine A1 (ABCA1) und G1 (ABCG1) und Scavenger-Rezeptor des Typs B1 reguliert wird. Die natürliche Akzeptor von Cholesterin im Plasma ist High Density Lipoprotein (HDL) und Apolipoprotein AI.
Die Cholesterin-Efflux Assay wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Cholesterin-Efflux aus kultivierten Zellen zu quantifizieren. Es misst die Fähigkeit von Zellen, Cholesterin Efflux und / oder die Kapazität des Plasmas Akzeptoren, Cholesterin aus den Zellen freigesetzt akzeptieren zu halten. Der Assay besteht aus den folgenden Schritten. Schritt 1: Markieren zellulärem Cholesterin mit indem markiertem Cholesterin im Serum enthaltenden Medium und Inkubation mit Zellen für 24-48 h. Dieser Schritt kann mit dem Laden der Zellen mit Cholesterin kombiniert werden. Schritt 2: Inkubation der Zellen in einem Serum-freien Medium auf markiertem Cholesterin unter allen intrazellulären Cholesterin-Pools sich ausgleichen lassen. Dieses Stadium kann mit der Aktivierung von zellulären ch kombiniert werdenolesterol Transporter. Schritt 3: Inkubation der Zellen mit der extrazellulären Akzeptor und Quantifizierung der Bewegung des markierten Zellen Cholesterin aus dem Akzeptor. Wenn Cholesterin Vorstufen wurden verwendet, um neu synthetisierte Cholesterin zu kennzeichnen, einen vierten Schritt, Reinigung von Cholesterin, erforderlich sein.
Der Test liefert folgende Informationen: (i), wie eine bestimmte Behandlung (eine Mutation, eine Knock-down, eine Überexpression oder eine Behandlung) die Kapazität der Zelle wirkt sich auf Efflux Cholesterin und (ii), wie die Kapazität des Plasma-Cholesterin-Akzeptoren zu akzeptieren durch eine Krankheit oder eine Behandlung beeinflusst. Diese Methode wird häufig in Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Forschung, metabolische und neurodegenerative Erkrankungen, Infektionskrankheiten und reproduktiven Erkrankungen eingesetzt.
Protocol
Discussion
Das beschriebene Verfahren zur Cholesterin-Efflux gemessen wurde entwickelt, um die Bewegung von Cholesterin aus den Zellen zu einer extrazellulären Cholesterin-Akzeptor zu messen. Es gibt einige kritische Überlegungen zum Verständnis dieser Methode.
Kennzeichnung und Äquilibrierung
In der beschriebenen Methode markierten Cholesterin im Serum enthaltenden Serum zugegeben. Obwohl dies nicht im Detail untersucht, wird angenommen, dass Cholesterin in Serum-Lipoprot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) (526615 und 545906) und zum Teil durch die Regierung von Victoria die OIS-Programm unterstützt. DS ist ein Fellow der NHMRC.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
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| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
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