Summary
Den cholesterol-assay er designet til at kvantificere graden af cholesterol efflux fra dyrkede celler og kapaciteten af plasma acceptorer til at modtage cholesterol frigivet fra cellerne. Analysen består af mærkning af celler med kolesterol, ligevægt af kolesterol blandt intracellulære pools og frigivelse af kolesterol til et ekstracellulært acceptor.
Abstract
Cholesterolindholdet af celler skal være inden for meget snævre grænser, for meget eller for lidt cholesterol i en celle resulterer i afbrydelse af cellulære membraner, apoptose og nekrose 1. Celler kan kilde kolesterol fra intracellulær syntese og fra plasmalipoproteiner, begge kilder er tilstrækkelige til fuldt ud at tilfredsstille cellernes krav til kolesterol. Processerne for kolesterol syntese og optagelse er stramt reguleret, og mangler af kolesterol er sjældne 2. Overdreven kolesterol er mere almindeligt problem 3. Med undtagelse af hepatocytter og i nogen grad adrenocorticale celler er celler, i stand til at nedbryde cholesterol. Celler har to muligheder for at reducere deres kolesterol indhold: at konvertere kolesterol i cholesterylestere, en mulighed med begrænset kapacitet, som overbelastning celler med cholesterylestrene er også giftigt, og cholesterol efflux, en option med potentielt ubegrænset kapacitet. Cholesterol efflux er specforsk proces, der reguleres af en række intracellulære transportører, såsom ATP-binding kassetten transportør proteiner A1 (ABCA1) og G1 (ABCG1) og scavenger-receptor type B1. Den naturlige acceptor af cholesterol i plasma er high density lipoprotein (HDL) og apolipoprotein AI.
Den cholesterol efflux assayet er designet til at kvantificere graden af cholesterol efflux fra dyrkede celler. Den måler kapaciteten af celler til at opretholde cholesterol efflux og / eller kapaciteten af plasma acceptorer til at modtage cholesterol frigivet fra cellerne. Assayet består af følgende trin. Trin 1: mærkning cellulær cholesterol ved tilsætning mærket cholesterol til serum-holdigt medium og inkubering med celler i 24-48 timer. Dette trin kan kombineres med lastning af celler med cholesterol. Trin 2: inkubation af celler i serumfrit medium for at ækvilibrere mærket cholesterol hos alle intracellulære cholesterol pools. Dette trin kan kombineres med aktivering af cellulære lmolesterol transportører. Trin 3: inkubering af celler med ekstracellulær acceptor og mængdebestemmelse af bevægelse af mærket cholesterol fra celler til acceptoren. Hvis cholesterol forstadier blev anvendt til at mærke nyligt syntetiserede cholesterol, et fjerde trin, oprensning af cholesterol, kan være nødvendig.
Analysen leverer følgende oplysninger: (i), hvordan en bestemt behandling (en mutation, en knock-down, en overekspression eller en behandling) påvirker effektiviteten af cellen til efflux kolesterol og (ii) hvordan kapaciteten af plasma acceptorer at acceptere kolesterol er påvirket af en sygdom eller en behandling. Denne metode anvendes ofte i forbindelse med hjerte-kar-forskning, metaboliske og neurodegenerative sygdomme, infektionssygdomme og reproduktive sygdomme.
Protocol
Discussion
Den beskrevne fremgangsmåde til måling cholesterol efflux er designet til at måle bevægelsen af cholesterol fra celler til en ekstracellulær cholesterol acceptor. Der er flere kritiske overvejelser i forståelsen af denne metode.
Mærkning og ækvilibrering
I den beskrevne metode mærket cholesterol sættes til serumholdigt serum. Selv aldrig undersøgt i detaljer, antages det, at cholesterol er inkorporeret i serumlipoproteiner, og de optages af ce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Sundhed og Medical Research Council of Australia (NHMRC) (526.615 og 545.906), og dels fra Victorias regering har OIS Program. DS er en fyr på NHMRC.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
|||||
| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
|||||
Riferimenti
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer’s bottle to Scap’s MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
- Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
- Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
- Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
- Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
- D’Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
- Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
- Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
- Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochimica. 46, 9388-9398 (2007).
- Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
- Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
- Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
- Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).
