Essai efflux de cholestérol
Summary
Le dosage du cholestérol est conçu pour quantifier le taux de cholestérol efflux partir de cellules cultivées et la capacité de plasma accepteurs d'accepter le cholestérol libéré par les cellules. Le test se compose de marquage des cellules avec le cholestérol, l'équilibration du cholestérol entre les pools intracellulaires et la libération de cholestérol à un accepteur extracellulaire.
Abstract
La teneur en cholestérol des cellules doit être maintenue dans les limites très étroites, trop ou trop peu de cholestérol dans quelques résultats de cellules dans la perturbation des membranes cellulaires, l'apoptose et nécrose 1. Les cellules peuvent cholestérol source à partir de la synthèse intracellulaire et de lipoprotéines plasmatiques, les deux sources sont suffisantes pour satisfaire pleinement les exigences des cellules pour le cholestérol. Les processus de synthèse du cholestérol et l'absorption sont strictement réglementées et les carences de cholestérol sont de 2 rares. Le taux de cholestérol excessif est de 3 problème le plus courant. À l'exception des hépatocytes et des cellules corticosurrénales degré, les cellules sont incapables de dégrader le cholestérol. Les cellules ont deux options pour réduire leur teneur en cholestérol: pour convertir le cholestérol en esters de cholestérol, une option avec une capacité limitée que la surcharge des cellules avec des esters de cholestérol est également toxique, et l'efflux de cholestérol, une option avec une capacité potentiellement illimitée. Efflux de cholestérol est un specprocessus de l'IFIC qui est réglementée par un certain nombre de transporteurs intracellulaires, comme liaison de l'ATP des protéines transporteur ABC A1 (ABCA1) et G1 (ABCG1) et de type B1 scavenger receptor. L'accepteur naturel de cholestérol dans le plasma est lipoprotéines de haute densité (HDL) et de l'apolipoprotéine AI.
Le test d'efflux de cholestérol est conçu pour quantifier le taux de l'efflux de cholestérol à partir de cellules cultivées. Il mesure la capacité des cellules à maintenir efflux de cholestérol et / ou la capacité de plasma accepteurs d'accepter le cholestérol libéré par les cellules. Le dosage comprend les étapes suivantes. Etape 1: étiquetage cholestérol cellulaire en ajoutant cholestérol marqué à milieu contenant du sérum et incubation avec des cellules de 24-48 h. Cette étape peut être combiné avec le chargement de cellules avec le cholestérol. Étape 2: l'incubation des cellules dans un milieu sans sérum pour équilibrer le cholestérol marqué parmi tous les bassins cholestérol intracellulaire. Cette étape peut être combiné avec l'activation de cellules chtransporteurs olesterol. Étape 3: l'incubation des cellules avec l'accepteur extracellulaire et la quantification du mouvement du cholestérol marqué à partir de cellules à l'accepteur. Si précurseurs du cholestérol ont été utilisés pour étiqueter le taux de cholestérol nouvellement synthétisé, une quatrième étape, la purification du cholestérol, peuvent être nécessaires.
Le test fournit les informations suivantes: (i) la façon dont un traitement particulier (une mutation, un knock-down, une surexpression ou un traitement) affecte la capacité de la cellule au cholestérol efflux et (ii) la façon dont la capacité d'accepteurs de plasma à accepter le taux de cholestérol est affecté par une maladie ou d'un traitement. Cette méthode est souvent utilisée dans le contexte de la recherche cardiovasculaire, des troubles métaboliques et neurodégénératives, infectieuses et maladies de la reproduction.
Protocol
Discussion
Le procédé décrit à mesurer efflux de cholestérol est conçu pour mesurer le mouvement du cholestérol des cellules à un accepteur de cholestérol extracellulaire. Il ya plusieurs considérations clés pour la compréhension de cette méthode.
L'étiquetage et l'équilibration
Dans la méthodologie décrite cholestérol marqué est ajouté au sérum contenant le sérum. Bien que n'ayant jamais étudié en détail, il est supposé que le taux de cho…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Santé nationale et du Medical Research Council de l'Australie (NHMRC) (526 615 545 906 et) et en partie par le programme gouvernemental victorienne OIS. DS est un membre de NHMRC.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
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| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
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| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
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Riferimenti
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer’s bottle to Scap’s MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
- Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
- Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
- Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
- Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
- D’Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
- Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
- Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
- Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochimica. 46, 9388-9398 (2007).
- Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
- Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
- Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
- Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).
