Vækst af Mycobacterium tuberculosis Biofilm
Summary
Mycobacterium tuberculosis danner narkotika tolerante biofilm når de dyrkes i visse betingelser. Her beskriver vi metoder til dyrkning af M. tuberkulose biofilm og bestemmer hyppigheden af narkotika tolerante persisters. Disse protokoller vil være nyttige til yderligere undersøgelser i mekanismerne af lægemiddel tolerance i M. tuberkulose.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, det ætiologiske agens for human tuberkulose, har en usædvanlig evne til at overleve mod miljømæssige påvirkninger, herunder antibiotika. Selvom stress tolerance over for M. tuberkulose er en af de sandsynlige bidragydere til 6-måneders lange kemoterapi af tuberkulose 1, de molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne egenskab fænotype af patogenet er fortsat uklare. Mange mikrobielle arter har udviklet sig til at overleve i stressende miljøer ved selvsamlende i velorganiseret, der er knyttet overflade, og matrix-indkapslede strukturer, der kaldes biofilm 2-4. Væksten i lokalsamfund synes at være en foretrukken overlevelsesstrategi af mikrober, og opnås ved hjælp af genetiske komponenter, der regulerer overflade fastgørelse, intercellulære kommunikation, og syntese af ekstracellulære polymere stoffer (EPS) 5,6. Tolerancen miljøbelastninger er sandsynligvis lettes ved EPS, og måske af physiologisk tilpasning af individuelle baciller til heterogene mikromiljøer i kompleks arkitektur af biofilm 7.
I en række af de seneste papirer vi fastslået, at M. tuberculosis og Mycobacterium smegmatis har en stærk tilbøjelighed til at vokse i organiserede multicellulære strukturer kaldet biofilm, som kan tåle mere end 50 gange den minimale inhiberende koncentrationer af de antituberkuløse lægemidler isoniazid og rifampicin 8-10. M. tuberkulose, men fængslende kræver specifikke betingelser for at danne modne biofilm, især 09:01 forholdet headspace: medier samt begrænset udveksling af luft med atmosfæren 9. Krav til specialiserede miljøforhold kan muligvis knyttes til det faktum, at M. tuberkulose er en obligat human patogen, og derfor har tilpasset væv miljøer. I denne publikation har vi demonstrere metoder til dyrkning af M. tuberkulosebiofilm i en flaske og en 12-brønds pladeformat, hvilket er bekvemt for bakteriologiske samt genetiske undersøgelser. Vi har beskrevet en protokol for en svækket stamme af M. tuberkulose, mc 2 7000, med deletion i de to loci, panCD og RD1, som er kritiske for in vivo vækst af patogenet 9. Denne stamme kan sikkert bruges i en BSL-2 inddæmning for at forstå den grundlæggende biologi tuberkulose patogenet og dermed undgå kravet om et dyrt BSL-3 anlæg. Fremgangsmåden kan udvides, med passende modifikation i medier, til at vokse biofilm af andre dyrkbar mykobakteriestammer.
Samlet set vil en ensartet protokol af dyrkning af mycobakterielle biofilm hjælpe efterforskerne interesseret i at studere de grundlæggende elastiske egenskaber mykobakterier. Desuden vil en klar og præcis metode til voksende mycobakterielle biofilm også hjælpe den kliniske og farmaceutiske investigators at teste effektiviteten af et potentielt lægemiddel.
Protocol
Discussion
Tuberkulose (TB), forårsaget af infektion med Mycobacterium tuberculosis, er fortsat en stor trussel mod den globale sundhed. Næsten en tredjedel af verdens befolkning skønnes at være asymptomatisk inficeret af patogenet, omkring 9 millioner nye tilfælde dukker op i klinikken hvert år med symptomer på aktiv TB, og omkring 1,7 millioner dør af infektionen hvert år 11. Den store byrde af sygdommen primært bidraget af mangel på en vaccine og en meget kompliceret kemoterapi, der involverer en …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev udført med økonomisk støtte fra National Institute for Health and American Lung Association.
Materials
| Equipment and supplies | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| Incubator | VWR | Model # 1923/25 |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 |
| 12-well tissue culture plate | VWR | 62406-165 |
| 50-mL conical tubes | VWR | 89039-660 |
| Rocker | Thermo Scientific | 57019-662 |
| Chromatographic refrigerator | VWR | 55702-520 |
| petri dish | VWR | 25384-342 |
| REAGENT | SUPPLIER | CATALOG NUMBER |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD | PX1565-1 |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 |
| L-asparagine | Sigma | A4284-100G |
| citric acid | Sigma | C1857-100G |
| ferric ammonium citrate | Sigma | F5879-100G |
| glycerol | EMD | GX0185-5 |
| NaOH | Sigma | S8045-500G |
| ZnSO4 | Sigma | Z4750-500G |
| D-pantothenic acid | Sigma | P2250-25G |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | Becton Dickinson | 271310 |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 |
| Tween-80 | Fisher | T164-500 |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 |
| 12 well plates | Falcon (BD) | 353043 |
| rifampicin | Sigma | R3501-1G |
| methanol | J.T. Baker | 9070-05 |
| 10mlLsyringe | Becton Dickinson | 301604 |
| 1-200μL pipet tips | VWR | 89079-458 |
| parafilm M | VWR | PM-996 |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | Becton Dickinson | 283810 |
| NaCl | Fisher | BP358-1 |
| KCl | Sigma | P9333-500G |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma | S0876-500G |
Riferimenti
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
