Denne undersøgelse beskriver en hidtil ukendt mikroplade assay, der måler FV koagulationsaktivitet under fibrinkoagel i humant plasma, som ikke er blevet rapporteret tidligere. Fremgangsmåden anvender en kinetisk mikropladelæser kontinuerligt at måle ændringen i absorbans ved 405 nm under fibrinkoagel i humant plasma.
Som reaktion på skade, er blodkoagulation aktiveres og resulterer i frembringelsen af koagulation protease, thrombin. Thrombin spalter fibrinogen til fibrin, som danner et uopløseligt koagulat der standser blødning. Faktor V (FV) i sin aktiverede form, FVA, er en kritisk co-faktor for protease FXa og accelerator for thrombindannelse ved fibrinkoagel dannelse som en del af prothrombinase 1, 2. Manuelle FV assays er blevet beskrevet 3, 4, men de er tidsrøvende og subjektiv. Automatiserede FV assays er rapporteret 5-7, men analysatoren og reagenser er dyre og giver normalt kun clottid, ikke hastigheden og omfanget af fibrindannelse. Mikroplade platform foretrækkes til måling enzymkatalyserede hændelser på grund af bekvemmelighed, tid, omkostninger, lille volumen, kontinuerlig overvågning og højt gennemløb 8, 9. Mikroplade-assays er blevet rapporteret for clotlyse 10, blodpladeaggregering11 og koagulationsfaktorer 12, men ikke for FV-aktivitet i humant plasma. Målet med fremgangsmåden var at udvikle en mikroplade assay, der måler FV aktivitet under fibrindannelse i humant plasma.
Denne hidtil ukendte mikroplade Metoden giver en enkel, billig og hurtig analyse af FV-aktivitet i humant plasma. Assayet udnytter en kinetisk mikropladelæser at overvåge absorbansændringen ved 405 nm under fibrindannelse i humant plasma (figur 1) 13. Assayet nøjagtigt måler den tid, begyndelseshastighed, og omfanget af fibrin koageldannelsen. Det kræver kun pi mængder plasma, er komplet i 6 min, er high-throughput, er følsom over for 24-80pM FV, og måler mængden af utilsigtet aktiveret (1-trins-aktivitet) og thrombin-aktiveret FV (2-trins-aktivitet ) for at opnå en fuldstændig vurdering af dens samlede funktionel aktivitet (2-fase-aktivitet – 1-trins aktivitet).
Formidlede intravascular koagulation (DIC) er en erhvervet koagulopati, der oftest udvikler sig fra allerede eksisterende infektioner 14. DIC er forbundet med en dårlig prognose og øger dødeligheden over den allerede eksisterende patologi 15. Assayet blev det vist, at hos 9 patienter med DIC, FV 1-fase 2-trins, og de samlede aktiviteter blev reduceret i gennemsnit med 54%, 44% og 42% sammenlignet med normal poolet humant henvisning plasma (NHP).
FV mikroplade-assay kan let tilpasses til måling af aktiviteten af en koagulationsfaktor. Denne analyse vil øge vores forståelse af FV biokemi gennem en mere nøjagtig og fuldstændig måling af dets aktivitet inden for forskning og kliniske omgivelser. Denne information vil medvirke hospitalsmiljøer gennem tidligere diagnose og udvikling af mere effektive behandlinger for koagulationsforstyrrelser, såsom DIC.
Den kinetiske mikroplade assayfremgangsmåde beskriver udviklingen af en hidtil ukendt, hurtig, billig og bekvem teknik til måling af FV koagulationsaktivitet i prøver af humant plasma, der ikke (FV 1-trins-assay) eller forsætligt er aktiveret med tilsat thrombin (FV 2-trins-assay). Assayet udnytter en kinetisk mikropladelæser, og alle materialer og reagenser, der er nødvendige er kommercielt tilgængelige eller kan fremstilles in-house. Assayet overvåger ændringen i lysspredning af plasma under fibrinkoagel dannelse ved 405 nm. Mikroplade assay har fordelen ved at bruge små plasma prøvevolumener (pi), og er anvendelig til analyse af multiple prøver samtidigt (op til 12). Disse assay-egenskaber er fordelagtige, når dyrt udstyr og reagenser anvendes (automatiske analyseindretninger og faktor-deficiente plasmaer) kun små prøvevolumener er tilgængelige (patientplasmaer) eller analyse af et stort antal prøver (I FV oprensning from plasma).
FV mikroplade-assay har den yderligere fordel, at den er bekvem, hurtig og kræver ikke isolering og oprensning af de krævede indgående komponenter. Sammenlignet med manuel tilt-rør 3, 4 og automatiserede 5-7 FV assays der er blevet rapporteret, har FV mikroplade assay sammenlignelig række nyttige blodprop gange (25-75 sek) og tilsvarende FV niveauer i stikprøven (0,5-0,005 enheder / ml) og følsomhed / detektionsgrænser (20-80pM). Sammenlignet med manuelle tilt-rør FV assays, der lider af en subjektiv visuel bedømmelse af koageldannelse 3, 4, tillader FV mikroplade-assay objektiv og kvantitativ måling af clottid, begyndelseshastighed, og omfanget af fibrin koageldannelsen. Sammenlignet med automatiserede FV assays, der lider af kravet om dyre analysatorer og reagenser 5-7, Fv mikroplatte assayreagenser og materialer er billige og alle de nødvendige materialer kan være opkøberesed kommercielt eller fremstillet in-house. Manuel tilt-rør 3, 4 og automatiserede 5-7 FV assays generelt kun give tid til koageldannelse, ikke tid, begyndelseshastighed, og omfanget af fibrin koageldannelse, som alle er nøjagtigt målt spektrofotometrisk med FV mikroplade-assay. Endelig manuelle tilt-rør 3,4 og automatiseret 5-7 FV assays lider kun at kunne måle FV-aktivitet i plasmaprøver en ad gangen, mens FV mikroplade-assay kan underkastes high-throughput og 12 prøver kan være analyseres samtidigt.
Mikroplade-assay blev anvendt til at påvise, at FV i 9 DIC patientplasmaer var mindre aktiv end i NHP på grund af en kombination af forsinkede koagulere tider og lavere indledende rater af koageldannelse i FV 1-trins assay. De initielle hastigheder af koageldannelse i FV 2-trins-assay i DIC patientplasmaer ikke blev ændret fra NHP. De omfang af koageldannelse i DIC patient plasma blev heller ikke ændret fra NHP i FV 1-trins og 2-trins-analyser. Nedsat FV 1-fase, 2-trins, og samlede aktiviteter kan have været på grund af øget FV forbrug 19 og / eller inaktivering 6 i overensstemmelse med andre undersøgelser i løbet af patogenesen af denne erhvervede blodsygdom. Betragtning af omfanget af koageldannelse i DIC plasmaer var det samme som iagttaget med NHP, var denne variabel mest sandsynligt et resultat af fibrinogenkoncentration i FV-deficient plasma og ikke relateret til karakteristika for de patientplasmaer.
Resultaterne fra mikroplade-assay indikerede, at målingen af FV-aktivitet i prøver af humant plasma kan opnås fra den tid og den indledende hastighed af koageldannelse fra FV 1-fase-assay og tiden for koageldannelse og total aktivitet fra FV 2 – fase assay. Det var ikke muligt at opnå kvantitativ måling af FV aktivitet i en plasmaprøve baseret på omfanget af dannelse af koagulat hos tHan FV 1 – og 2-trins-assays eller den indledende grad af koageldannelse i FV 2-trins assay. Tillægges alle reaktioner nåede omtrent samme omfang af koageldannelse på fra 0,35 til 0,45 enheder mellem den oprindelige absorbans før og maksimal absorbans efter thromboplastin og calciumchlorid kommer, at måling af omfanget af koageldannelse ikke tilvejebringe en kvantitativ vurdering af FV aktivitet i en given plasmaprøve.
Den hidtil ukendte mikroplade-assay vil finde anvendelse inden for forskning og kliniske omgivelser til måling af FV-aktivitet i prøver af humant plasma og fraktioner under dets oprensning fra menneskers og dyrs plasma. Mikroplade assay kan anvendes til at måle den tid, begyndelseshastighed, og omfanget af koageldannelse; parametre generelt ikke overvåges samtidig i manuelle tilt-tube assays og automatiske koagulation analysatorer. Denne information giver mere af en fuldstændig kvantitativ vurdering af inddragelse af FV under koageldannelse begivenhedi humant plasma end tidligere rapporteret 3-7. Denne information er især vigtigt inden for både forskning og kliniske laboratorier ved måling af væsentlige ændringer i FV-aktivitet i prøver af plasma eller med renset FV eller FVA. FV mikroplade-assay kan også anvendes til at karakterisere og måle forbindelser, som kan aktivere eller inaktivere FV og FVA, måle FV-aktivitet hos patienter med risiko for venøs thrombose som følge af FV Leiden mutation 20, 21 og til at overvåge aktiviteten af FV under dets oprensning fra plasma.
FV mikroplade-assay kan let tilpasses til måling af aktiviteten af en koagulationsfaktor i den ydre, indre eller fælles pathway anvendelse af det passende faktor-deficient plasma og initiere reagenser til fibrindannelse. Analysen vil øge vores forståelse af FV biokemi gennem en mere nøjagtig og fuldstændig måling af dets aktivitet inden for forskning og kliniske laboratorier. Ultimately, vil disse oplysninger positiv indflydelse hospitalsmiljøer gennem tidligere diagnose og udvikling af mere effektive behandlinger for personer ramt af koagulationsforstyrrelser, såsom DIC.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen blev støttet med faglig udvikling og forskning Startup fondene fra The University of Ontario Institute of Technology (UOIT) til Dr. John A. Samis og en canadisk Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award til Irina Levit. Forfatterne anerkender Shannon Everett (Undervisning og Learning Centre, UOIT) for hendes assistance forberede videoen. Forfatterne erkender Dr. Michael E. Nesheim (Institut for Biokemi, Dronningens University, Kingston, ON) for hans mentorskab, indsigt og personer diskussioner. Forfatterne også erkende Dr. Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hæmostase og Trombose Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK) for at tilvejebringe de DIC patientplasmaer anvendt i undersøgelsen.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
NaCl | Fisher | BP358-212 | |
Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |