Denne studien beskriver en roman mikroplate metode som måler FV koagulasjon aktivitet under fibrinkoagel dannelse i human plasma som ikke har vært rapportert tidligere. Metoden bruker en kinetisk mikroplateleser for kontinuerlig å måle endring i absorbans ved 405nm under fibrinkoagel dannelse i human plasma.
I respons til skade, er blod koagulasjon aktivert og resulterer i generering av clotting protease, trombin. Trombin spalter fibrinogen til fibrin som danner et uløselig blodpropp som stopper blødning. Faktor V (FV) i sin aktiverte form, FVA, er en kritisk kofaktor for proteasen FXa og akselerator av trombin generasjon under fibrinkoagel formasjon som del av en prothrombinase, 2. Manuelle FV assays er beskrevet 3, 4, men de er tidkrevende og subjektive. Automatiserte FV analysene rapportert 5-7, men analysatoren og reagenser er dyrt og generelt gir bare clot tid, ikke hastigheten og omfanget av fibrindannelse. Mikroplate plattformen foretrekkes for måling enzym-katalysert hendelser på grunn av bekvemmelighet, tid, kostnader, mindre volum, kontinuerlig overvåking og high-throughput 8, 9. Mikroplate analyser har blitt rapportert for blodpropp lysering 10, blodplateaggregasjon11, og koagulasjonsfaktorene 12, men ikke for FV aktivitet i humant plasma. Målet med metoden var å utvikle en mikroplate metode som måler FV aktivitet under fibrin formasjon i humant plasma.
Denne romanen mikroplate metoden skisserer en enkel, billig, og rask analyse av FV aktivitet i humant plasma. Analysen benytter en kinetisk mikroplateleser å overvåke absorbansen endre på 405nm under fibrindannelse i humanplasma (Figur 1) 13. Analysen måler nøyaktig tid, innledende hastighet, og omfanget av fibrinkoagel formasjon. Det krever kun ul mengder plasma, er komplett i 6 min, har høy gjennomstrømning, er følsom for 24-80pM FV, og måler mengden av utilsiktet aktivert (1-trinns-aktivitet) og trombin-aktivert FV (2-trinns-aktivitet ) for å oppnå en fullstendig vurdering av sin samlede funksjonell aktivitet (2-trinns-aktivitet – 1-trinns-aktivitet).
Spres intravaskretsløp koagulasjon (DIC) er en ervervet koagulopati som oftest utvikler seg fra pre-eksisterende infeksjoner 14. DIC er assosiert med en dårlig prognose og øker dødelighet i forhold til før-eksisterende patologi 15. Analysen ble brukt til å vise at det i 9 pasienter med DIC, FV 1-trinns, to-trinns, og total aktivitet var redusert i gjennomsnitt, med 54%, 44%, og 42%, sammenlignet med normal humane referanse plasma (NHP).
FV mikroplate-analysen er enkelt tilpasses for å måle aktiviteten i alle koagulasjonsfaktor. Denne analysen vil øke vår forståelse av FV biokjemi gjennom en mer nøyaktig og fullstendig måling av sin virksomhet innen forskning og kliniske settinger. Denne informasjonen vil positivt påvirke helsevesenet gjennom tidligere diagnose og utvikling av mer effektive behandlinger for koagulasjonsforstyrrelser, for eksempel DIC.
Den kinetiske mikroplate analysemetoden skisserer utviklingen av en ny, rask, billig og praktisk teknikk for måling av FV koagulasjon aktivitet i prøver av humant plasma, som har ikke (FV 1-trinns metode), eller har blitt bevisst aktivert med tilsatt trombin (FV 2-trinns metode). Analysen benytter en kinetisk mikroplateleser og alle materialer og reagenser som kreves er kommersielt tilgjengelige eller kan bli gjort i huset. Analysen overvåker kontinuerlig endring i lysspredningen av plasma under fibrinkoagel dannelse ved 405nm. Mikroplate analysen har fordelen av å bruke liten plasma prøvevolumer (ul), og er mottagelig for analyse av flere prøver samtidig (opp til 12). Disse analysebetingelser attributter er fordelaktig når dyrt utstyr og reagensene brukes (Automated analysatorer og Faktor-mangelfull plasmaer), bare små prøvevolumer er tilgjengelige (Pasient plasmaer) eller analysere et stort antall prøver (Under FV rensing trom plasma).
FV mikroplate analysen har de ekstra fordeler som det er praktisk, rask, og krever ikke at isolering og rensing av de nødvendige bestanddeler. Sammenlignet med manuell tilt-tube 3, 4 og automatiserte 5-7 FV analyser som har blitt rapportert, har FV mikroplate analysen sammenlignes rekke nyttige blodpropp ganger (25-75 sek) og tilsvarende FV nivåer i utvalget (0.5 til 0.005 enheter / ml), og følsomhet / deteksjonsgrense (20-80pM). Sammenlignet med manuelle tilt-tube FV analyser som lider en subjektiv visuell vurdering av koageldannelse 3, 4, tillater FV mikroplate analysen objektiv og kvantitativ måling av blodpropp tid første rate, og omfanget av fibrinkoagel formasjon. Sammenlignet med automatiserte FV analyser som lider fra kravet dyre analysatorer og reagenser 5-7, FV mikroplate analysereagensene og materialer er billig og alle nødvendige materialer kan være kjøpersed kommersielt eller gjort in-house. Manuell tilt-rør 3, 4 og 5-7 automatiserte FV analyser generelt bare gi tid for dannelse av blodpropper, ikke tiden, innledende hastighet, og omfanget av fibrinkoagel dannelse som alle nøyaktig målt spektrofotometrisk med FV mikroplate analysen. Endelig manuell tilt-røret 3,4 og automatisert 5-7 FV analyser lider bare å være i stand til å måle FV aktivitet i plasmaprøver en om gangen, mens FV mikroplate-analysen er mottagelig for høy gjennomstrømning og 12 prøver kan være analysert samtidig.
Mikroplate analysen ble brukt til å vise at FV i 9 DIC pasientgrupper plasmaer var mindre aktiv enn i NHP grunn av en kombinasjon av forsinkede blodpropp ganger og lavere innledende forekomst av dannelse av blodpropper i FV 1-trinns metode. De første tallene for dannelse av blodpropper i FV 2-trinns metode i DIC pasienten plasmaer ikke ble endret fra NHP. De grad av dannelse av blodpropper i DIC patient plasmaer var heller ikke endret fra NHP i FV 1-trinns og to-trinns-analyser. Redusert FV 1-trinns, 2-trinns, og samlede virksomhet kan ha vært på grunn av økt FV forbruk 19 og / eller inaktivering 6 i samsvar med andre studier i løpet av patogenesen av dette ervervet blodsykdom. Gitt omfanget av dannelse av blodpropper i DIC plasmaer var det samme som observert med NHP, var denne variabelen mest sannsynlig et resultat av fibrinogen konsentrasjon i FV-mangelfull plasma og ikke relatert til egenskapene pasienten plasmaer.
Resultatene fra mikroplate analysen indikerte at måling av FV aktivitet i prøver av humant plasma kan fås fra den tid og initiell hastighet på koageldannelse fra FV 1-trinns metode, og tidspunktet for dannelse av blodpropper og total aktivitet fra FV 2 – trinns metode. Det var ikke mulig å oppnå kvantitativ måling av FV aktivitet i en plasmaprøve basert på omfanget av koageldannelse i than FV 1 – og 2-trinns assays eller den første rate av dannelse av blodpropper i FV 2-trinns metode. Gitt alle reaksjoner nådde omtrent samme grad av dannelse av blodpropper av 0,35 til 0,45 enheter mellom den innledende absorbansen før og maksimal absorbans etter thromboplastin og kalsiumklorid dessuten ikke måling av utstrekningen av koageldannelse ikke gi en kvantitativ vurdering av FV aktivitet i en gitt plasmaprøve.
Romanen mikroplate analysen vil finne anvendelse i forskning og kliniske innstillinger for måling av FV aktivitet i prøver av humant plasma og fraksjoner under dets rensing fra human og animalsk plasma. Den mikroplate analysen kan brukes til å måle tiden, innledende hastighet, og omfanget av koageldannelse; parametre ikke generelt overvåkes samtidig i manuelle tilt-tube assays og automatiserte koagulasjon analysatorer. Denne informasjonen gir mer av en komplett kvantitativ vurdering av involvering av FV under dannelse av blodpropper hendelseni humant plasma enn har tidligere vært rapportert 3-7. Denne informasjonen er spesielt viktig i både forskning og kliniske laboratorier ved måling betydelige endringer i FV aktivitet i prøver av plasma eller med renset FV eller FVA. FV mikroplate analysen kan også bli brukt for å karakterisere og måle forbindelser som kan aktivere eller inaktivere FV og FVA, måle FV aktivitet hos pasienter med risiko for venøs trombose som følge av FV Leiden mutasjon 20, 21 og for å overvåke aktiviteten av FV under sin renselse fra plasma.
FV mikroplate-analysen er enkelt tilpasses for å måle aktiviteten i alle koagulasjonsfaktor i ytre, indre, eller felles vei med riktig faktor-mangelfull plasma og initiere reagenser for fibrindannelse. Analysen vil øke vår forståelse av FV biokjemi gjennom en mer nøyaktig og fullstendig måling av sin virksomhet innen forskning og kliniske laboratorier. Ultimately, vil denne informasjonen positivt påvirke helsevesenet gjennom tidligere diagnose og utvikling av mer effektive behandlinger for personer rammet med koagulasjonsforstyrrelser, for eksempel DIC.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen ble støttet med fagutvikling og forskning Oppstart midler fra University of Ontario Institute of Technology (UOIT) til Dr. John A. samer og en kanadiske Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award til Irina Levit. Forfatterne erkjenner Shannon Everett (Undervisning og læring Centre, UOIT) for hennes assistanse forbereder videoen. Forfatterne erkjenner Dr. Michael E. Nesheim (Department of Biochemistry, Queens University, Kingston, ON) for sin mentor, innsikt og nyttige diskusjoner. Forfatterne erkjenner også Dr. Cheng Hock Toh (Roald Dahl Hemostase og Trombose Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK) for å gi DIC pasienten plasmaer som brukes i studien.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
NaCl | Fisher | BP358-212 | |
Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |