Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Summary

Verfahren zur Isolierung von einzelnen Zellen der Netzhaut und anschließende Amplifikation der cDNA beschrieben. Einzelzell-Transcriptomics zeigt den Grad der zellulären Heterogenität in einem Gewebe und deckt neuen Markergene für seltene Zellpopulationen. Die beigefügten Protokoll kann eingestellt werden, um viele verschiedene Zelltypen zu entsprechen.

Abstract

Hoch spezialisierte, aber außerordentlich klein Populationen von Zellen spielen eine wichtige Rolle in vielen Geweben. Die Identifizierung von Zelltyp-spezifische Marker und Genexpression bei extrem seltenen Zellpopulationen war eine Herausforderung unter Verwendung von Standard-gesamte Gewebe Ansätze. Genexpressionsanalysen von einzelnen Zellen ermöglicht einen beispiellosen Zugang zu Zelltypen, die nur einen kleinen Prozentsatz des gesamten Gewebes ^1-7 umfassen. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet, um die Genexpression, die vorübergehend in eine kleine Anzahl von Zellen während der dynamischen Entwicklungsübergänge ⁸ exprimiert zu prüfen.

Diese Ausgabe der zellulären Vielfalt stellt sich im Rahmen des zentralen Nervensystems (ZNS), wo neuronale Verbindungen zwischen ganz unterschiedlichen Zellen vorkommen können ^9. Die genaue Anzahl unterschiedlicher Zelltypen ist nicht genau bekannt, aber es wurde geschätzt, dass mehr als 1000 verschiedene Arten in der Rinde i seintself ^10. Die Funktion (en) von komplexen neuronalen Schaltkreise können auf einige der seltenen Arten neuronaler und die Gene die sie ausdrücken verlassen. Durch die Identifizierung neuer Marker und helfen, molekular klassifizieren verschiedene Neuronen, ist die Single-Cell-Ansatz besonders nützlich bei der Analyse von Zelltypen im Nervensystem. Es kann auch helfen, die Mechanismen der neuralen Entwicklung durch Identifizierung differentiell exprimierter Gene und Gen-Bahnen während der frühen Stadien der neuronalen Vorläuferzellen Entwicklung aufzuklären.

Als einfache, leicht zugängliche Gewebe mit erheblichen neuronalen Vielfalt, ist die Retina von Wirbeltieren als ein Modellsystem für die Untersuchung der Prozesse der zellulären Entwicklung, neuronale Differenzierung und neuronaler Diversifikation. Doch wie in anderen Teilen des ZNS, kann dieser zelluläre Vielfalt ein Problem für die Bestimmung der genetischen Signalwege, die retinalen Vorläuferzellen zu fahren, um eine bestimmte Zelle Schicksal annehmen zu präsentieren, zumal die Stäbchen-Photorezeptoren aus denen der maMehrheit der gesamten Netzhaut Zellpopulation ^11. Hier berichten wir ein Verfahren zur Identifizierung der Transkripte in einzelner retinaler Zellen (1) ausgedrückt. Die einzelnen Zellen Profilierung Technik erlaubt die Beurteilung der Menge an Heterogenität, in verschiedenen Zellpopulationen der Netzhaut ^2,4,5,12. Darüber hinaus hat diese Methode eine Reihe von neuen Kandidatengenen, die Rolle (n) in die Zelle Schicksal Entscheidungsprozesse, die in Teilmengen von retinalen Vorläuferzellen ⁸ auftreten können, spielen enthüllt. Mit wenigen einfachen Anpassung des Protokolls, kann diese Technik für viele verschiedenen Geweben und Zelltypen verwendet werden.

Protocol

1. Zelldissoziation Ein Flussdiagramm, das Protokoll wird gezeigt, Abbildung 1 ist. Für die Bestellnummern der einzelnen Reagenzien in diesem Protokoll verwendet, entnehmen Sie bitte Tabelle 1. Sezieren die Netzhaut in einem PBS-Bad. Während der Dissektion, ist es am besten, den Glaskörper und die Linse, da halten sie mit der Netzhaut kann die Dissoziation behindern entfernen. Es ist nicht immer von entscheidender Bedeutung für alle dem retinalen Pigmentepithel (RPE) zu e…

Discussion

Eine ständig wachsende Zahl von Studien belegen, robust Zell-zu-Zell-Variabilität in Populationen, die angeblich besser homogen hinsichtlich ihrer Genexpression ^6,8 wurden. In mindestens einem Fall wurde dieses Gen Expression "Rauschen" wurde gezeigt, dass ein biologischer spielen ^13. Die Genexpression Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen werden verdeckt auf traditionelle Ganzkörper-Gewebe-Methoden. In diesen Versuchen werden das Expressionsprofil von einem "durchschnittlich…

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.