Одноклеточный профилирования развивающихся и зрелых нейронов сетчатки

Summary

Метод для выделения одной клетки сетчатки и последующему усилению их кДНК описаны. Одноклеточный транскриптомику показывает степень сотовой настоящее время неоднородность ткани и открывает новые маркерных генов редких клеточных популяций. Сопровождающих протокол может быть скорректирована в соответствии с различными типами клеток.

Abstract

Узкоспециализированные, но очень небольшие популяции клеток играют важную роль во многих тканях. Определение клеточного типа маркеров и программы для экспрессии генов крайне редки подмножества клетка была проблема с использованием стандартных все ткани подходов. Экспрессия генов профилирования отдельных клеток позволяет беспрецедентный доступ к типам клеток, которые составляют лишь небольшой процент от общей ткани ^1-7. Кроме того, эта методика может быть использована для изучения экспрессии генов программы, которые временно выражается в небольшом количестве клеток в процессе динамического развития переходов ^8.

Этот выпуск сотовых разнообразие возникает повторно в центральной нервной системе (ЦНС), где нейронные связи могут возникнуть между весьма разнообразны клеток ^9. Точное число различных типов клеток, точно не известно, но было подсчитано, что там может быть больше, чем 1000 различных типов в коре яtself ^10. Функция (ы) сложные нейронные цепи могут рассчитывать на некоторые редкие типы нейронов и генов, которые они выражают. По выявлению новых маркеров и помогает молекулярно классифицировать различные нейроны, одноклеточные подход особенно полезен при анализе типов клеток в нервной системе. Это также может помочь выяснить механизмы развития нервной системы путем выявления разному экспрессируются гены и ген пути на ранних стадиях развития нейронных предшественников.

В качестве простого, легко доступны ткани с большим разнообразием нейронов, сетчатки позвоночных является отличной модельной системой для изучения процессов клеточного развития, нейронов и нейронных дифференциации диверсификации. Однако, как и в других отделах центральной нервной системы, этот сотовый разнообразие может представлять собой проблему для определения генетических путей, которые ведут сетчатки предшественников принять конкретные судьбы клетки, особенно учитывая, что стержень фоторецепторов составляют машинство общей популяции клеток сетчатки ^11. Здесь мы приводим метод для идентификации протоколов выразил в одной клетки сетчатки (рис. 1). Одноклеточные профилирования метод позволяет для оценки количества неоднородность настоящее время в различных клеточных популяций сетчатки ^2,4,5,12. Кроме того, этот метод выявил целый ряд новых генов-кандидатов, которые могут играть роль (ы) в клетке судьбы процессах принятия решений, которые происходят в подмножества сетчатки клеток-предшественников ^8. С помощью нехитрых изменений в протокол, этот метод может быть использован для различных тканей и типов клеток.

Protocol

1. Клеточная диссоциация Блок-схема с изложением протокол показана Рисунке 1. Для каталожных номеров частности реагенты, используемые в этом протоколе см. Таблицу 1. Проанализируйте сетчатки в ванне PBS. Во время вскрытия, то лучше удалить стекловидное те?…

Discussion

Постоянно расширяющийся ряд исследований выявления надежных клетки к клетке изменчивость в популяциях, которые считались более однородными с точки зрения их экспрессии гена ^6,8. По крайней мере в одном случае, это экспрессия генов "шум", как было показано, играют важную биоло…

Materials

Reaction mixtures:

Cell Lysis buffer

0.45 μ	10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
0.23 μl	10% NP-40
0.23 μl	0.1M DTT
0.05 μl	RNase Inhibitor (40 U/μl)
0.05 μl	SUPERase-In (20U/μl)
0.13 μl	Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
0.09 μl	dNTPs (2.5 mM each)
3.27 μl	dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)

Tailing Reaction Mixture

0.18 μl	100 mM dATP
0.6 μl	10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)
4.62 μl	dH2O
0.3 μl	TdT (400 U/μl)
0.3 μl	RNase H (2 U/μl)

PCR Reaction Mixture

10 μl	10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+
10 μl	2.5 mM dNTPs
0.2 μl	Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl)
1 μl	Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl)
68.8 μl	dH2O

10X One-Phor All Buffer

0.5M	Potassium acetate
0.1M	Tris acetate (pH 7.6)
0.1M	Magnesium acetate

Solutions:

10X Phosphate buffered saline (1 liter)

80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na₂PO₄
2.4 g KH₂PO₄
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Vertical needle puller	David Kopf Instruments	Model 750
Microcapillary tubes	Sigma	P0674
Aspirator tube assembly	Sigma	A5177
Corning filter tips (100-1000 μl	Fisher Scientific	07-200-265
Hank’s balanced salt solution (1X)	Lonza BioWhittaker	10-508F
HEPES buffer (1M)	MP Biomedicals	091688449
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
DNase I	Roche	04716728001
papain	Worthington	LS03126
Superscript III	Invitrogen	18080-044
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	AM2682	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
SUPERase-In	Applied Biosystems	AM2694	These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.
Modified Oligo d(T) primer (gel purified)	Oligos ETC		We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.
T4 gene 32 protein	New England Biolabs	M0300L
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S
TdT	Roche	3 333 574	As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.
RNase H	Invitrogen	18021-014
Ex-Taq HS Polymerase	Takara	RR006A
Biotin N6-ddATP	Enzo Biosciences	42809

Table 1. Specific reagents and equipment.