में Proprioceptors का विज़ुअलाइज़ेशन<em> ड्रोसोफिला</em> लार्वा और pupae

Summary

लार्वा और pupae में chordotonal अंगों immunostain और कल्पना विधि<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> वर्णित है.

Abstract

Proprioception के लिए शरीर के भीतर उत्पन्न होने वाली उत्तेजनाओं को जवाब देने से गति, या शरीर के अंगों की स्थिति, भावना की क्षमता है. Fruitflies और अन्य कीड़ों में proprioception विशेष संवेदी अंगों में कहा chordotonal (ChOs) अंगों ² द्वारा प्रदान की गई है. ड्रोसोफिला में कई अन्य अंगों की तरह है, ChOs मक्खी के जीवन चक्र के दौरान दो बार विकसित करना. पहले, लार्वा ChOs के embryogenesis दौरान विकसित करना. तो, वयस्क ChOs के लार्वा कीड़े की तुरीयावस्था (पूरे बन जाने की स्थिति) से संबंधित डिस्क में विकसित करने और जारी रखने के के कायापलट दौरान अंतर शुरू करते हैं.

embryogenesis के दौरान लार्वा ChOs के के विकास ^{10,11,13,15,16} बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है. प्रत्येक चो के centerpiece एक संवेदी इकाई एक न्यूरॉन और एक scolopale सेल से बना है. संवेदी इकाई सहायक कोशिकाओं के दो प्रकार है कि विशेष epidermal लगाव ^1,9,14 कोशिकाओं के माध्यम से छल्ली के लिए देते हैं के बीच फैला है. जब एक उड़ लार्वा चाल के, ई के सापेक्ष विस्थापनpidermal लगाव कोशिकाओं संवेदी इकाई और dendrite ^8,12 के बाहरी खंड में विशिष्ट क्षणिक रिसेप्टर संभावित vanilloid (TRPV) चैनल के फलस्वरूप खोलने की खींच ले जाता है. हासिल संकेत तो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में हरकत केंद्रीय पैटर्न जनरेटर सर्किट के लिए स्थानांतरित कर दिया.

एकाधिक ChOs वयस्क ⁷ मक्खी में वर्णित किया गया. वयस्क मक्खी उपांग (पैर, पंख और halters) के जोड़ों के पास और छाती और पेट में स्थित हैं. इसके अलावा, ChOs के कई सैकड़ों को सामूहिक रूप से वयस्क ऐन्टेना में जॉनसन अंग है कि transduce ध्वनिक के रूप में यांत्रिक ऊर्जा ^3,5,17,4 के लिए.

भ्रूण चरणों में ChOs के विकास के बारे में व्यापक ज्ञान के विपरीत, लार्वा चरणों के दौरान इन अंगों की आकृति विज्ञान के बारे में बहुत कम जाना जाता है. इसके अलावा, में और्विक ChOs के अपवाद के ¹⁸ और जॉनसन अंग के साथ, हमारे ज्ञानजीई और वयस्क उड़ में ChOs के विकास संरचना के बारे में बहुत टूटा हुआ है.

यहाँ हम तीसरे instar लार्वा और pupae में ChOs धुंधला हो जाना और visualizing के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि आनुवंशिक उपकरणों के साथ एक साथ लागू कर सकते हैं बेहतर आकारिकी विशेषताएँ और मक्खी में विभिन्न ChOs के के विकास को समझने की.

Protocol

इससे पहले कि आप शुरू वांछित मक्खी संस्कृतियों आगे बढ़ें. Uncrowded (लगभग 50 मिलीग्राम शीशी प्रति 30 मक्खियों) शीशियों रखें. शीशी में से प्रत्येक में केवल एक दिन के लिए मक्खियों अंडे देना. यह लार्वा पर्याप्त खाद्य आपूर्ति प्रदान करते हैं और उन्हें भोजन से बाहर रेंगने से पहले अधिक से अधिक आकार तक पहुँचने के लिए अनुमति देगा. उचित तापमान में शीशियों रखें जब तक तीसरे instar लार्वा शीशी दीवार पर भटकने के लिए शुरू. तैयार फॉस्फेट की एक ताजा स्टॉक (पीबीएस) खारा और पीबीटी पीबीएस में (0.1% बीच) बफर. पीबीएस की बर्फ पर 10 मिलीलीटर रखें. ताजा लगानेवाला के 1-5 मिलीग्राम (पीबीटी में 4% Formaldehyde) तैयार है और यह बर्फ पर रहते हैं. हम एक शेयर के समाधान के रूप में बोतलबंद formaldehyde के 37-38% का उपयोग करें. 1. और तीसरा Instar लार्वा का विच्छेदन फिक्सेशन शीशी दीवार से एक भटक तीसरे instar लार्वा उठाओ और यह एक 50 एक Sylgard विच्छेदन (एक Sylgard 184 सिलिकॉन इलास्टोमेर किट के, डॉव Corning निगम के बने प्लेट पर बहुत ठंडा पीबीएस μl ड्रॉप में जगहसंस्कृति पकवान ऊतक). लार्वा, पृष्ठीय पक्ष पकड़ो, मुँह हुक के पास, ठीक संदंश (Dumont संदंश # 5) का उपयोग कर, और एक कीट के लार्वा के मस्तिष्क के माध्यम से पिन है (minutien, 0.1 मिमी, स्टेनलेस स्टील) छड़ी. संदंश साथ लार्वा के पीछे अंत पकड़ो, धीरे खींच और से लार्वा लंबाई धीरे खिंचाव है. दो पीछे spiracles के बीच में एक और कीट पिन रहो. का प्रयोग वसंत कैंची शरीर दीवार में दो क्षैतिज चीरों (पूर्वकाल – पश्च अक्ष को सीधा), पूर्वकाल और कूल्हों पिन करने के लिए करीब कटौती. वसंत कैंची का प्रयोग पूर्वकाल से पीछे चीरा पृष्ठीय midline के साथ लार्वा शरीर दीवार कटौती. आंतरिक अंगों (पेट, लार की गिल्टी, malpighian नलिकाओं आदि) और ट्रेकिआ ठीक संदंश का उपयोग निकालें. धीरे पीबीएस के साथ एक या दो बार धो लें. संदंश के साथ दो शरीर दीवार फ्लैप पकड़ो, उन्हें बाहर खिंचाव और उन्हें थाली प्रत्येक पक्ष के लिए दो कीट पिन का उपयोग करने के लिए पिन. पी निकालेंबी एस और जोड़ने फिक्सिंग समाधान (पीबीटी में 4% formaldehyde) का 50 μl. कमरे के तापमान पर 20 मिनट सेते हैं. लगानेवाला निकालें. पीबीएस के साथ दो बार धो लें. कीट पिन खींचो. का प्रयोग वसंत कैंची लार्वा सिर और पूंछ एक आयताकार पट्टिका छोड़ने में कटौती. पीबीएस के साथ एक ठंडा Eppendorf ट्यूब स्थानांतरण निश्चित ऊतक. एक बार लार्वा की एक पर्याप्त संख्या तय कर रहे हैं, एक सीधे प्रतिरक्षी धुंधला करने के लिए जारी रख सकते हैं. यदि तत्काल धुंधला वांछित नहीं है, निश्चित लार्वा 95% इथेनॉल के साथ 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक, धोया जाना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर 95% इथेनॉल में संग्रहित 2. विच्छेदन और pupae निर्धारित मैं भाग के रूप में लार्वा निर्धारण के लिए शीशियों में भाग लें, जब तक तीसरे instar लार्वा pupariate शुरू करते हैं. शीशियों हर घंटे और निशान लार्वा कि pupariated है जांच करते हैं. चिह्नित pupae 29 24 डिग्री सेल्सियस, या 24-27 घंटे में 30-40 घंटे विकसित करने के लिए अनुमति दें डिग्री सेल्सियस ठीक संदंश का प्रयोग वीं के 20-30 pupae लेनेई उपयुक्त उम्र और उन्हें एक अंधेरे बहु – अच्छी तरह से चीनी मिट्टी के बरतन विदारक डिश में डाल दिया. ब्याज के ऊतकों को नुकसान नहीं सावधान रहो. पोटा संबंधी मामले से pupae निकालें. बंद operculum छीलने के द्वारा शुरू करो और जारी रखने के लिए जब तक कोषस्थ कीट मुक्त है. कोषस्थ कीट में एक अच्छी तरह से पीबीटी साथ भरा रखो. सभी pupae निकालने जारी रखें. 2.4-2.6 कदम एक समय में पांच pupae के छोटे समूहों में किया जाना चाहिए. विदारक पकवान के कुओं के बीच एक फ्लैट सतह पर पांच pupae रखें. एक माइक्रो विच्छेदन चाकू का प्रयोग सिर की नोक कटौती और पेट के पीछे टिप (वैकल्पिक रूप से, यह संभव है करने के लिए संदंश के दो जोड़े उपयोग pupae के दोनों सिरों पर छेद आंसू). ठीक जगह का उपयोग संदंश में कोषस्थ कीट पकड़ और 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने के लिए पूर्वकाल खोलने के माध्यम से पीबीटी इंजेक्शन लगाने के द्वारा कोषस्थ कीट की आंतरिक अंगों धो. यह एक अच्छी तरह से पीबीएस के साथ भर में सूई द्वारा dissected कोषस्थ कीट संक्षिप्त धो और एक Eppendorf बर्फ पर रखा ट्यूब में ठंडा लगानेवाला में यह कदम. 4 में रातोंरात (पर) सेते हैं डिग्री सेल्सियस भाग द्वितीय लगानेवाला त्यागें और पीबीटी साथ pupae तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक, धो लो. बर्फ पर धोया pupae रखें. पीबीटी साथ विदारक पकवान की दो कुओं भरें. कुओं की एक पॉलीथीन पाश्चर विंदुक हस्तांतरण कई pupae का उपयोग करना. दूसरे में अच्छी तरह से एक समय में एक कोषस्थ कीट ले जाएँ. पूरी तरह से गठबंधन सुझावों के साथ तेज संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, विंग की पारदर्शी पोटा संबंधी छल्ली बंद छील: कोषस्थ कीट से अच्छी तरह से उपयोग संदंश की एक जोड़ी के नीचे करने के लिए सुरक्षित है, और धीरे संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग छल्ली आंसू. एक बार छल्ली, पंख बंद छील फाड़ा है. कोषस्थ कीट से पंख नहीं डिस्कनेक्ट करने के लिए सावधान रहें. विंग ब्लेड से छल्ली बंद छीलने के बाद, पंख काज (जहां विंग ChOs स्थित हैं) की छल्ली छीलने जारी है. विंग छल्ली छीलने के बाद, एक एक समान तरीके से पैर छल्ली बंद छीलने का प्रयास कर सकते हैं.कई पैर प्रक्रिया में खो जाने की संभावना है, लेकिन कम उपज बावजूद, इस कदम को अत्यधिक के बाद से यह बहुत पैर ChOs का धुंधला में सुधार की सिफारिश की है. Haltere और पेट की ChOs आगे छल्ली बंद छीलने के बिना देखे जा सकते हैं. एक Eppendorf मेथनॉल के साथ भरा ट्यूब में 'खुली' कोषस्थ कीट प्लेस और कमरे के तापमान पर रखना है. बंद सभी pupae की छल्ली छीलने जारी है, और उन्हें एक ही ट्यूब को जोड़ने. 10 कम से कम अच्छी तरह से खुली pupae प्रत्येक धुंधला के लिए एकत्र किया जाना चाहिए. मेथनॉल निकालें और 95% इथेनॉल के साथ तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक, धो लो. निश्चित pupae -20 डिग्री सेल्सियस पर 95% इथेनॉल में समय की लंबी अवधि के लिए रखा जा सकता है 3. लार्वा और pupae की Immunostaining पीबीटी तीन बार, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के साथ तय ऊतक धो लें. लार्वा एक rotating प्लेट पर कोमल झटकों के साथ धोया जा सकता है. Pupae मिलाते हुए बिना धो रहे हैं. अवरुद्ध (बफर के साथ पीबीटी बदलें पीबीटी +% 5 एनormal बकरी सीरम) और 4 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस अवरुद्ध बफर निकालें और 4 बजे डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी (बफर अवरुद्ध में पतला) के साथ सेते हैं धो पीबीटी साथ चार बार के रूप में 3.1 कदम में वर्णित है. पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीटी सेते हैं और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ निकालें (बफर अवरुद्ध में पतला) पीबीटी साथ दो बार धो और पीबीएस के साथ एक बार के रूप में 3.1 कदम में वर्णित है. बढ़ते मध्यम (Dako प्रतिदीप्त बढ़ते मध्यम (Dako Cytomation, Glostrup, डेनमार्क) और 4 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस बदलें. 4. लार्वा के बढ़ते लार्वा उनके छल्ली नीचे का सामना करना पड़ रहा है और शरीर की दीवार मांसपेशियों को सामना करना पड़ के साथ बढ़ते मीडिया की एक बूंद में एक खुर्दबीन स्लाइड पर बढ़ रहे हैं. एक साफ कवर पर्ची पर बढ़ते मध्यम की एक छोटी सी बूंद रखो और इसे का उपयोग करने के लिए तैयारी को कवर. घुड़सवार लार्वा पर कोई दबाव नहीं लागू होते हैं. 5. Pupae के बढ़ते दो खुर्दबीन स्लाइड तैयारबढ़ते मध्यम, एक विच्छेदन के लिए और बढ़ते के लिए दूसरा एक बूंद के साथ. एक स्लाइड पर कई pupae रखो. का प्रयोग वसंत कैंची सिर और पेट के पीछे भाग को हटा दें. उदर आधे से पंख और पैरों के बीच काटने से छाती की पृष्ठीय आधे से अलग करें. बढ़ते समाधान की एक बूंद में दूसरे खुर्दबीन स्लाइड पर विच्छेदित कोषस्थ कीट के शरीर के अंगों को रखें. सुनिश्चित करें कि पंख और पैरों को बाहर खींच रहे हैं और ऊतकों के overlaying जितना संभव हो कम करने की कोशिश. एक कवर पर्ची पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद प्लेस और नमूना से अधिक जगह है. घुड़सवार नमूना पर दबाव लागू नहीं है. 6. प्रतिनिधि परिणाम तीसरे instar लार्वा की इम्युनो दाग ChOs का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है. यह उदाहरण एक अच्छी तरह से बढ़ाकर पेट खंड जिसमें सात आठ ChOs की स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं दर्शाता है. न्यूरॉन्स प्रयोगशालाMAb22C10 साथ eLED (01:20, आयोवा विश्वविद्यालय में विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त), टोपी, बंधन, टोपी लगाव और बंधन लगाव कोशिकाओं विरोधी αTub85E (1:10, क्लेन एट अल के साथ लेबल रहे हैं, 2010). फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी, Cy3, या Cy5 संयुग्मित anti-mouse/rabbit (1:200, जैक्सन Immunoresearch प्रयोगशालाओं) थे. नमूने confocal माइक्रोस्कोपी (510 एल एस एम, Zeiss) का उपयोग करते हुए देखा गया. एक 35 घंटा पुराने कोषस्थ कीट की उदर रेडियल नस में पंख ChOs के एक क्लस्टर चित्रा 2 में दिखाया गया है. चित्रा 1 (ए) छह कोशिका प्रकार है कि एक एकल Ch के अंग गठन की योजनाबद्ध चित्रण. टोपी (सीए) लगाव टोपी (सी), scolopale (एस), न्यूरॉन (एन), (एल) बंधन और बंधन लगाव (ला ). LCh5 अंग है, जिसमें पांच ChOs क्लस्टर पार्श्व अनुप्रस्थ मांसपेशियों के समूह (एलटी भर में फैला है1-4). पार्श्व अनुदैर्ध्य मांसपेशी (LL1), उदर अनुदैर्ध्य मांसपेशियों (VL1-4) और पार्श्व तिरछा मांसपेशी (LO1) भी सचित्र हैं. कण्डरा कोशिकाओं (क्लेन एट अल, 2010 से लिया) भूरे रंग के क्षेत्रों के रूप में सचित्र हैं. (बी) एक एक तिहाई instar लार्वा के पेट खंड एक 10X बढ़ाई पर देखा जा सकता है. सात आठ प्रत्येक उदर खंड में मौजूद ChOs की स्पष्ट हैं: पांच पार्श्व अंगों है कि एक साथ pentascolopidial (LCh5) अंग, एक एकल पार्श्व अंग (LCh1) के और एक दो उदर ChOs (VChB) के रूप में. ChOs के न्यूरॉन्स (एन) neuronal मार्कर एमएबी 22C10 (लाल) के साथ लेबल रहे हैं. बंधन (एल), टोपी (सी) और लगाव कोशिकाओं (ला, सीए) के साथ लेबल रहे हैं विरोधी αTub-85E (नीला). टोपी और बंधन कोशिकाओं को अतिरिक्त GFP चो विशेष संवाददाता से देई ठिकाना (Nachman एट अल. अप्रकाशित डेटा) एक नियामक तत्व को शरण देने के साथ लेबल रहे हैं. चित्रा 2. </strong> उदर रेडियल नस में पंख chordotonal अंगों एक 40X बढ़ाई पर देखा जाता है. न्यूरॉन्स (एन) neuronal मार्कर 22C10 (लाल, बी) के साथ चिह्नित कर रहे हैं. (एल) बंधन और टोपी कोशिकाओं (सी) सह विरोधी αTub85E एंटीबॉडी (ब्लू, सी) और एक चो विशेष GFP संवाददाता transgene (Nachman एट अल. अप्रकाशित डेटा) के साथ लेबल.

Discussion

इस वीडियो में वर्णित प्रोटोकॉल लार्वा और पोटा संबंधी चरणों के दौरान proprioceptive ChOs कल्पना करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. संरचना और proprioceptive ChOs के विकास के बारे में अध्ययन किया गया है अब तक मुख्य रूप से भ्रूण चरणों और लार्वा कीड़े की तुरीयावस्था (पूरे बन जाने की स्थिति) से संबंधित डिस्क को प्रतिबंधित. इस प्रकार, दोनों लार्वा और वयस्क ChOs के विकास के बाद के चरणों के कई पहलुओं को काफी हद तक अनजान रहते हैं. वर्णित प्रोटोकॉल, ड्रोसोफिला में आम आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, की पहचान करने और नए जीन और मार्ग है कि ChOs विकास के बाद के चरणों में एक भूमिका निभा का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल चो के दृश्य के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन यह पोटा संबंधी ⁶ पंख के रूप में अन्य ऊतकों, के धुंधला हो जाना के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Materials

Name of the reagent/tool	Company	Catalogue number	Comments
Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip	F.S.T	11252-20 or 11252-10 (or similar forceps)
Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm	Roboz Surgical Instrument Co	RS-6083-10
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW Corning Corporation	240.4019862
Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm)	AS Mdeizintechnik GmbH	11-590-00	Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co.
Orbital shaker – Rotamax-120	Heidolph	N/A
Dako Fluorescent Mounting Medium	Dako Cytomation, Glostrup, Denmark	DK-5302392
X10 PBS formulation	2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O		The quality of PBS is critical for the success of this protocol
PBT	X1 PBS + 0.1% Tween 20