والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK
Summary
إجراء فحص في الوقت الحقيقي لتحديد الأدوية التي تتفاعل مع بروتين G-K بوابات المعدل نحو الداخل<sup> +</supيوصف> (GIRK) قنوات. الفحص يستخدم غشاء المحتملة التي تراعي الأصباغ الفلورية لقياس نشاط GIRK قناة. هذا الأسلوب هو قابل للتكيف للاستخدام على عدد من خطوط الخلايا.
Abstract
G البروتين بوابات الداخل المعدل K + (GIRK) قنوات العمل كوسطاء الخلوية من مجموعة واسعة من الهرمونات والناقلات العصبية، ويتم التعبير عنها في الدماغ والعضلات والهيكل العظمي والقلب والغدد الصماء 1،2 الأنسجة. قنوات GIRK أصبح تفعيلها بعد ملزم من يغاندس (الناقلات العصبية والهرمونات، والمخدرات، … الخ) والبلازما على غشاء محدد، G-الديناميكي بروتين المستقبلات (GPCRs). هذا الربط يؤدي إلى تحفيز بروتينات جي (G i و س G) الذي ربط في وقت لاحق إلى وتفعيل قناة GIRK. فتحت مرة واحدة في قناة GIRK يسمح لحركة K + الخروج من الخلية مما تسبب في غشاء يستريح القدرة على أن تصبح أكثر سلبية. ونتيجة لذلك، GIRK تنشيط الخلايا العصبية في قناة يقلل عفوية تشكيل إمكانات العمل ويحول دون الإفراج عن الناقلات العصبية مثير. في القلب، وتفعيل قناة GIRK يكبح نشاط جهاز تنظيم ضربات القلب وبالتالي تباطؤ في دقات القلب.
<pالطبقة = "jove_content"> قنوات GIRK تمثل أهدافا جديدة لتطوير العوامل العلاجية الجديدة لعلاج ألم الأعصاب، وإدمان المخدرات، وعدم انتظام ضربات القلب وغيرها من الاضطرابات 3. ومع ذلك، فإن علم الصيدلة من هذه القنوات لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. على الرغم من أن عدد من الأدوية بما في ذلك مكافحة عدم اتساق نبضات القلب وكلاء، والعقاقير المضادة للذهان ومضادات الاكتئاب منع قناة GIRK، هذا تثبيط ليست انتقائية، وتحدث في تركيزات عالية نسبيا المخدرات 3.هنا، نحن تصف فحص فحص في الوقت الحقيقي لتحديد جهري جديد من القنوات GIRK. في هذا الاختبار، يتم تحميل خلايا العصبية AtT20، معربا عن قنوات GIRK، مع إمكانية الأصباغ الحساسة للغشاء فلوري مثل مكرر (1،3-dibutylbarbituric حامض) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] أو HLB 021-152 (الشكل 1 ). جزيئات الصبغة تصبح امتصاص التالية فلوري بقوة في الخلايا (الشكل 1). علاجمن الخلايا مع يغاندس النوع من الاختزال يحفز قنوات GIRK لفتح. الناتج K + هروب رأس المال للخروج من الخلية يسبب غشاء المحتملة لتصبح أكثر سلبية وإشارة إلى تخفيض فلوري (الشكل 1). وبالتالي، يمكن أن يعاير العقاقير التي تعدل K + هروب رأس المال من خلال قناة GIRK باستخدام قارئ لوحة فلوري. خلافا لغيرها من المقايسات ايون فحص القناة، مثل مطياف الامتصاص الذري (4) أو تحليل المشع 5، وفحص قناة GIRK فلوري يوفر إجراء فحص سريع، في الوقت الحقيقي وغير مكلفة.
Protocol
Discussion
في حين تم استخدام غشاء المحتملة التي تراعي الأصباغ الفلورية لتحديد العقاقير التي تعدل القنوات الأيونية 9،10، وهذا هو أول تقرير من طلباتهم للحصول على الخلايا العصبية GIRK اكتشاف المخدرات قناة. الفحص قناة GIRK فلوري المقدمة هنا يوفر طريقة سريعة وموثوقة وفي الوقت الح?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الصحة العامة في الولايات المتحدة جائزة الخدمة NS-071530.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | CellGro | 10-013 |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
| 96-well plates | Corning | 3603 |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
| Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
| Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
| Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.
Riferimenti
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
