ניסיונות להביע סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR) ב<em> Saccharomyces cerevisiae</em> יש, עד כה, הניב כמויות נמוכות יחסית של חלבון. זה פרוטוקול של חומרים כימיים הקשורים מופץ באמצעות קרן סיסטיק פיברוזיס צריך לאפשר הכנת כמויות מיליגרם של זה "קשה" חלבון הקרום האיקריוטים.
סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR) הוא ערוץ כלוריד, כי כאשר מוטציה, יכול להצמיח סיסטיק פיברוזיס ב humans.There ולכן עניין רב חלבון זה, אבל המאמצים ללמוד את המבנה שלה ואת הפעילות כבר הקשו על ידי קושי להביע וטיהור כמות מספקת של חלבון 1-3. כמו הרבה חלבונים "קשה" קרום האיקריוטים, ביטוי באורגניזם בצמיחה מהירה רצוי, אבל מאתגר, וגם את השמרים ס cerevisiae, עד כה התקבלו סכומים נמוכים והשפלה מהיר של חלבון רקומביננטי נצפתה 4-9. חלבונים המעורבים בעיבוד של CFTR רקומביננטי בשמרים תוארו 6-9. בדו"ח זה אנו מתארים מתודולוגיה ביטוי CFTR בשמרים וטיהור שלה בכמויות משמעותיות. הפרוטוקול מתאר כיצד הבעיות proteolysis קודמות ניתן להתגבר וכיצד רמות הביטוי שלCFTR ניתן לשפר באופן משמעותי את הצמיחה על ידי שינוי תנאי התא על ידי שליטה בתנאי אינדוקציה, בתקופת זמן מסוימת לפני קצירת התא. את reagants הקשורות לפרוטוקול זה (Murine CFTR-לבטא בתאי שמרים או פלסמידים שמרים) יופץ באמצעות פיברוזיס סיסטיק ארה"ב קרן, אשר מימנה את המחקר. מאמר המתאר את עיצוב וסינתזה של CFTR לבנות המועסקים דו"ח זה יפורסם בנפרד (Urbatsch, י,. Thibodeau, פ ואח', לא פורסם). במאמר זה נסביר תחילת השיטה שלנו עם המעבר של התאים שמרים עם CFTR לבנות – השמרים המכיל פלסמיד (איור 1). יש לבנות את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) רצף התמזגו כדי CFTR בתחנה הסופית C-שלה מלווה את המערכת שפותחה על ידי דרו et al. (2008) 10. GFP מאפשר ביטוי וטיהור של CFTR להיות אחריו בקלות יחסית. Protoc יופיטר דמיינוגימורים ol לאחר הכנת microsomes מן בתאי שמרים, אם כי אנו כוללים מספר הצעות טיהור של חלבון מן microsomes את. לקוראים מומלץ להוסיף שינויים משלהם הליך טיהור גופיפון, תלוי את הניסויים הסופיים להתבצע עם חלבון ו ציוד המקומית לרשותם. שמרים לידי ביטוי חלבון CFTR יכול להיות מטוהרים באופן חלקי מתכת באמצעות יונים זיקה כרומטוגרפיה, באמצעות תג פנימי לטיהור polyhistidine. כרומטוגרפיה לאחר בגודל הדרה מניב חלבון נראה> 90% טהור, נשפט על ידי SDS-PAGE ו-Coomassie מכתים של ג'ל.
מאמר זה מספק שיטה ביטוי של חלבון CFTR Murine בתאי שמרים, שאמור להקל על מחקר על סיסטיק פיברוזיס. המטרה היא לקשר את הנייר עם שחרורו של Murine CFTR מבנה ה-DNA, אשר יהיה זמין דרך סיסטיק פיברוזיס קרן ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Orthologs אחר צריך להיות זמין במועד מאוחר יותר. טרנספורמציה של תאים שמרים עם וקטור המכיל CFTR היא פשוטה, אך חשוב למסך המושבות המבטאים רמות גבוהות של CFTR. רמות הביטוי משתנים עשוי לנבוע ממספר גורמים, אבל מספר העותקים של התא לכל פלסמיד כנראה אחראית במידה לא מבוטלת של וריאציה. השלבים הקריטיים המתוארים כאן אמור לאפשר ייצור של CFTR-לבטא בתאי שמרים CFTR, המכילים ממברנות microsomal. לאחר השינוי, הצמיחה, קציר תמוגה של תאים שמרים כבר שולט, purification של החלבון צריך להיות אפשרי, באיור 3 נתנו דוגמה של טוהר, כי צריך להיות בר השגה במקרה זה כאמת מידה שימושי. אין בכוונתנו בכתב היד הזה כדי לספק מתודולוגיה מפורטת טיהור של החלבון. עם זאת, ישנם כמה צעדים קריטיים טיהור במורד הזרם ספציפיים במערכת ביטוי S.cerevisae, כגון תמוגה התא וטיהור גופיפון, ואלה נכללו בפירוט כתב היד הזה. יש לציין, עם זאת, כי מלבד שתי השיטות בהן השתמשנו, שיטות חלופיות תא שמרים שיבוש יכול להיות מועסק, כגון שימוש של תא הלחץ הצרפתי. חלבון רקומביננטי יש TeV-cleavable בטרמינל C-GFP מושלם המאפשר לחלבון להיות במעקב אחרי הגיוס (איור 4). שמרים יש חלבון 70kDa פנימי (כנראה succinate dehydrogenase 12), מאיר, בתנאים זהים 11, וזה יכול לספק בין שימושיכיול סטנדרטי NAL את רמות הביטוי היחסיות של CFTR של תמציות תאים או microsomes שלמים (איור 3). ברור מהנתונים שמוצג בתרשים 4, כי העיתוי של קצירת התא לאחר אינדוקציה עם גלקטוז הוא קריטי. תשואות ירידה CFTR בתלילות לאחר שעות על 16 האינדוקציה, כך שיש כמעט בכל CFTR להבחין בתאי שמרים לאחר 24 שעות של אינדוקציה.
תשואה של חלבונים מטוהרים הוא על חלבון 1 2mg-CFTR לכל תרבות fermenter 15 ליטר. השחזור ניתן להעריך גם על 70% של חלבון CFTR-GFP הכולל עד שלב גופיפון, והתאוששות על 25% מטוהרים חלבון. אפיון של ס ' cerevisiae, הביע CFTR היא מתמשכת. כפי שניתן לראות באיור. 4, מיקום של חלבונים בתוך התא יכול להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אמנם רוב הקרינה נמצא סביב בפריפריה של התא כמו 10 הצפויה, כמה חלבון מציג לוקליזציה punctate, או, אורק בתוך קרום הפלזמה אשר יכול להיות בגלל CFTR מיחזור דרך מסלול Golgi / endosomal בסוף 14 או אולי במורד הזרם של תא נביטה של שלפוחית התחבורה של ER 4. טיפול PNGaseF, אנזים deglycosylates חלבונים, הראה שינוי מינימלי ההגירה של הלהקה חלבון CFTR על SDS-PAGE, רומז כי הוא unglycosylated, או שיש לו glycosylation מינימלי 15. ניסויים המדינה זירחון של חלבון נמצאים בעיצומם. בכמה חומרי ניקוי שנבדקו עד כה, חלבונים מטוהרים מציג פעילות ATPase (כי הוא עצור על ידי מעכבי CFTR ספציפי 16) במחירים דומים לאלה שפורסמו בעבר 2,15. מדידה של פעילות הערוץ CFTR ידרוש הכינון מחדש של חלבונים מטוהרים, שפירושה צעד לטיהור הסופי חומר ניקוי בעל ריכוז גבוה יחסית קריטי micelle (CMC) 17. שמרים microsomes containinגרם CFTR ניתן solublised עם חומרי ניקוי המועסקים בדרך כלל מספר 18, כולל חומרי ניקוי כגון dodecyl maltoside 2, אשר נחשבים בדרך כלל להיות "מתונה". אולם חומרי ניקוי CMC עליון הוכיחו להיות יעיל עבור solubilsation, עד כה, טוען כי חילופי לתוך חומרי ניקוי אלה יש לשקול בשלב מאוחר בתוכנית כלשהי טיהור.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים סיסטיק פיברוזיס קרן (CFF) למימון עבודה זו דרך CFTR Consortium שלה מבנה 3D (מספר מענק FORD08XX0). אנו מכירים את התרומה הענקית של כל עמיתינו בתוך Consortium לעבודה זו, בעיקר בעיצוב של הגנים CFTR. כמו כן, אנו מכירים את תרומתם שלא תסולא בפז של בני הזוג. ג'יימס Birtley (NCSR Demokritos, יוון), מארק יאנג (אוניברסיטת קרדיף, אנגליה) ודוד דרו (אימפריאל קולג', לונדון, בריטניה) בשלבים המוקדמים של העבודה. אנחנו במיוחד להודות לד"ר אינה Urbatsch (טקסס טק. אוניברסיטת Lubbock) לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue No |
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | ||
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 |
Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 |
D-galactose | Fisher | BP656-500 |
D-glucose | Fisher | D16-500 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Tris-HCl | Fisher | P631 |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
Glycerol | Fisher | 065017 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 |
Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 |
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 |
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | |
Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Vortex mixer | Star Labs | |
Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 |
LAS3000 imaging system | Fuji | |
20l fermenter vessel and control unit | Applikon | |
Constant systems cell disrupter | Constant systems | |
Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 |
JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |