Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Summary

Neurônios receptores olfativos (ORNs) converter sinais de odor primeiro em um receptor de corrente que por sua vez desencadeia potenciais de ação que são transmitidos para os neurônios de segunda ordem no bulbo olfativo. Aqui, descrevemos a técnica da pipeta de sucção para gravar simultaneamente o receptor de odorante induzida atual e os potenciais de ação de ORNs mouse.

Abstract

Animais provar o ambiente à sua volta odorous através dos sistemas chemosensory localizados na cavidade nasal. Sinais chemosensory afetar comportamentos complexos como a escolha alimentar, predador, conspecific e reconhecimento mate e outras pistas socialmente relevantes. Neurônios receptores olfativos (ORNs) estão localizados na parte dorsal da cavidade nasal embutido no epitélio olfativo. Esses neurônios bipolares enviar um axônio para o bulbo olfatório (ver fig. 1, Reisert & Zhao ^1, publicada originalmente no Jornal de Fisiologia Geral) e estender um único dendrito da fronteira epitelial de onde irradiam os cílios no muco que cobre o olfativo epitélio. Os cílios contêm o mecanismo de transdução de sinal que conduz finalmente à excitatórios influxo de corrente através dos canais de transdução ciliares, um nucleotídeo cíclico-gated canal (CNG) e um Ca ^{2 +-activated} Cl ^– canal (Fig. 1). O que se seguiu depolarization desencadeia geração do potencial de ação no corpo celular ^2-4.

Neste vídeo, descrevemos o uso da "técnica da pipeta de aspiração" para gravar odorante respostas induzidas a partir de ORNs. Este método foi desenvolvido originalmente para gravar de bastonetes ⁵ e uma variante deste método pode ser encontrado em jove.com modificado para gravar a partir de fotorreceptores de rato cone ^6. A técnica da pipeta de sucção foi mais tarde adaptado para gravar também a partir ORNs ^7,8. Resumidamente, após a dissociação do epitélio olfactivo e isolamento de células, o corpo de célula inteira de um ORN é sugado para dentro da ponta de uma pipeta de gravação. O dendrite e dos cílios permanecer exposta à solução do banho e, portanto, acessível a solução muda para permitir, por exemplo odorante ou bloqueador aplicação farmacológica. Nesta configuração, não têm acesso ao ambiente intracelular é obtida (sem fixador de tensão de célula inteira) e a tensão intracelular é livre de variar. Isso tudouxos a gravação simultânea do atual receptor lento que se origina na cílios e potenciais de ação rápidos disparados pelo corpo celular ^9. A diferença na cinética entre estes dois sinais permite que eles sejam separados utilizando diferentes configurações de filtro. Esta técnica pode ser utilizada em qualquer tipo selvagem ou de rato knockout ou para gravar selectivamente a partir de ORNs que também expressam GFP para rotular subconjuntos específicos de ORNs, por exemplo, expressando um receptor de odorante dado ou canal iónico.

Protocol

1. A configuração de gravação A câmara de gravação é montada num microscópio invertido Nikon Eclipse TE2000U com óptica de contraste de fase, que é montado em uma mesa de ar e electricamente blindado utilizando uma gaiola de Faraday. A câmara de Plexiglass gravação é composto por duas secções parcialmente separados por uma barreira e coladas sobre uma lâmina de vidro silanizado. Uma secção da câmara é usado para resolver as células, enquanto o outro é usado para o estí…

Discussion

<p class="jove_content"> A técnica da pipeta de aspiração é um método eletrofisiológico que é utilizado para registar o odor da corrente induzida do receptor lento e os potenciais de acção rápida a partir de um bifásicos ORN simultaneamente. Desde que a membrana plasmática da célula não seja ultrapassado, este método deixa o meio intracelular imperturbado assegurar que as respostas odorant não são alterados devido a alterações da concentração de iões no citoplasma ou de diluição de factores intracelulares. As células…

Materials

Name of the material	Tipo	Company	Catalogue / Model number	Comments
Air table	equipment	Newport
Air Pump	equipment	Newport	ACGP
Pipette Puller	equipment	Sutter	P-97
Borosilicate glass	equipment	WPI	1B150-4
Nikon Eclipse Inverted microscope	equipment	Nikon	TE2000U	Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least
Amplifier PC-501A	equipment	Warner	64-0008	Headstage 1 GΩ
Diamond knife	Equipment	Custom-made
Digitizer Mikro1401 A/D	equipment	Cambridge Electronic Design
Filter unit 3382	equipment	Krohn Hite corporation
Signal	software	Cambridge Electronic Design
Molded Ag/AgCl Pellet	equipment	WPI	64-1297
Pipette holder	equipment	Warner	64-0997	Custom modified to fit headstage
Recording chamber	Equipment	Custom-made
Micromanipulator MP85-1028	equipment	Sutter Instrument	Micromanipulator MP85-1028
Mineral oil	Solution	Sigma	330779-1L
Oscilloscope TDS 1001	equipment	Tektronix
Three-barreled square glass tube	Equipment	Warner	64-0119	0.6 mm ID , 5 cm long
Valve	equipment	The Lee Company
Valvelink 8.2	equipment	Automate Scientific
SF-77B Perfusion fast step	equipment	Warner