Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Summary

Neuronas olfativas del receptor (ORNs) convertir señales de olor primero en un receptor de corriente que a su vez desencadena los potenciales de acción que se transmiten a las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio. Aquí se describe la técnica de pipeta de succión de grabar simultáneamente el receptor de odorizantes de la corriente inducida y los potenciales de acción de ORNs ratón.

Abstract

Animales muestras del medio ambiente oloroso alrededor a través de los sistemas quimiosensoriales situados en la cavidad nasal. Señales Quimiosensoriales afectar los comportamientos complejos, como la elección de alimentos, depredador, conespecíficos y reconocimiento mate y otras señales de relevancia social. Neuronas olfativas del receptor (ORNs) se encuentra en la parte dorsal de la cavidad nasal incrustado en el epitelio olfativo. Estas neuronas bipolares enviar un axón hasta el bulbo olfatorio (ver fig. 1, Reisert y Zhao ^1, originalmente publicado en la revista Journal of General Physiology) y extender una sola dendrita epitelial de la frontera desde donde irradian los cilios en el moco que recubre el olfato epitelio. Los cilios contienen la maquinaria de transducción de señales que en última instancia conduce a excitatorios afluencia corriente a través de los canales de transducción ciliar, un nucleótido cíclico-gated canal (CNG) y un Ca ^{2 +-activado} Cl ^– canal (Fig. 1). El siguiente depolarización desencadena la generación del potencial de acción en el cuerpo de la célula ^2-4.

En este video se describe el uso de la "técnica de succión pipeta" para grabar olor inducida por las respuestas de ORNs. Este método fue desarrollado originalmente para grabar desde fotorreceptores de los bastones ⁵ y una variante de este método se puede encontrar en jove.com modificado para grabar desde fotorreceptores de los conos de ratón ^6. La técnica de la pipeta de aspiración fue adaptado más adelante para grabar también de ORNs ^7,8. Brevemente, tras la disociación del epitelio olfatorio y aislamiento de células, el cuerpo de la célula entera de una ORN es aspirado en la punta de una pipeta de grabación. La dendrita y los cilios del permanecer expuesto a la solución del baño y por lo tanto accesibles a la solución cambia para permitir por ejemplo odorante o aplicación bloqueador farmacológico. En esta configuración, no hay acceso al medio intracelular se gana (sin fijación de voltaje de células enteras) y la tensión intracelular es libre de variar. Todo estoDebe A la grabación simultánea de la corriente del receptor lento que se origina en los cilios y los potenciales de acción rápida disparados por el cuerpo celular ^9. La diferencia en la cinética entre estas dos señales que les permite ser separados utilizando diferentes configuraciones de filtro. Esta técnica se puede utilizar en cualquier tipo salvaje o el ratón knockout o de grabación selectiva de ORNs que también expresan GFP para etiquetar subconjuntos específicos de ORNs, por ejemplo, que expresa un receptor determinado olor o canal de iones.

Protocol

1. La configuración de grabación La cámara de registro está montado en un microscopio Nikon Eclipse TE2000U invertida con óptica de contraste de fase que está montado sobre una mesa neumática y eléctricamente blindado usando una jaula de Faraday. La cámara de grabación de Plexiglás consta de dos secciones separadas parcialmente por una barrera y pegado sobre un portaobjetos de vidrio silanizado. Una sección de la cámara se utiliza para liquidar las células, mientras que el otro s…

Discussion

<p class="jove_content"> La técnica de pipeta de succión es un método electrofisiológico que se utiliza para registrar la corriente inducida por el receptor de olor lento y los potenciales de acción rápida bifásicos de un ORN simultáneamente. Puesto que la membrana plasmática de la célula no se rompe, este método deja el medio intracelular no perturbado asegurar que las respuestas de olor no se alteren debido a los cambios de las concentraciones iónicas citoplasmáticas o dilución de factores intracelulares. Las células se pued…

Materials

Name of the material	Tipo	Company	Catalogue / Model number	Comments
Air table	equipment	Newport
Air Pump	equipment	Newport	ACGP
Pipette Puller	equipment	Sutter	P-97
Borosilicate glass	equipment	WPI	1B150-4
Nikon Eclipse Inverted microscope	equipment	Nikon	TE2000U	Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least
Amplifier PC-501A	equipment	Warner	64-0008	Headstage 1 GΩ
Diamond knife	Equipment	Custom-made
Digitizer Mikro1401 A/D	equipment	Cambridge Electronic Design
Filter unit 3382	equipment	Krohn Hite corporation
Signal	software	Cambridge Electronic Design
Molded Ag/AgCl Pellet	equipment	WPI	64-1297
Pipette holder	equipment	Warner	64-0997	Custom modified to fit headstage
Recording chamber	Equipment	Custom-made
Micromanipulator MP85-1028	equipment	Sutter Instrument	Micromanipulator MP85-1028
Mineral oil	Solution	Sigma	330779-1L
Oscilloscope TDS 1001	equipment	Tektronix
Three-barreled square glass tube	Equipment	Warner	64-0119	0.6 mm ID , 5 cm long
Valve	equipment	The Lee Company
Valvelink 8.2	equipment	Automate Scientific
SF-77B Perfusion fast step	equipment	Warner